本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
酸菜制品作为一种传统的健康食品，以其酸鲜纯正、清爽可口、回味悠长、解腻开胃，营养丰富及其保健功效，越来越引起人们的关注。传统的酸菜是以大白菜为原料，利用蔬菜自身携带的乳酸菌等微生物进行发酵生产。但酸菜制品中通常含有大量亚硝酸盐，亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高，大剂量的亚硝酸盐能够引起高铁血红蛋白症，导致组织缺氧，还可使血管扩张血压降低，人体摄入0.2克～0.5克即可引起中毒，3克可致死，严重危害人体健康。
亚硝酸盐还原酶（nitritereductase，简称nir）能催化no2-反应生成no或者nh3，从而降低因亚硝酸盐积累所造成的危害作用，它存在于许多反硝化细菌中。传统方法发酵酸菜，乳酸菌数量有限，不能最大限度降解亚硝酸钠，亚硝酸盐等副产物多且存在大量有害物质，危害人体健康，因此需要有效降解亚硝酸盐的菌剂，以提高酸菜食用安全性。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂，本发明还提供了复合菌剂的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂，所述复合菌剂由植物乳杆菌冻干菌粉、短乳杆菌冻干菌粉、赖氏乳杆菌冻干菌粉、乳酸片球菌冻干菌粉等质量混合。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）富集培养基：
植物乳杆菌、短乳杆菌、赖氏乳杆菌、乳酸片球菌分别在基础培养基上添加2~5%w/v碳源和0.2~0.6％w/v氮源构成富集培养基，30~35℃培养40h；
（2）富集条件：在步骤（1）基础上优化生长条件，ph6.0~6.5，温度28~35℃，采用静止或摇动培养方式；
（3）浓缩条件：在步骤（2）增菌后菌体液的基础上，通过4000~8000r/min，10~20min条件下离心浓缩富集的菌体；
（4）菌株冻干：将浓缩后的菌体分别与冻干保护剂v/v=1:1混合，置于冻干机内冻干得到植物乳杆菌的冻干菌粉、短乳杆菌的冻干菌粉、赖氏乳杆菌的冻干菌粉，乳酸片球菌的冻干菌粉；
（5）菌株配比：将步骤（4）中得到的4种冻干菌粉等质量混合，即得到复合菌剂。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，步骤（1）中富集培养基分别为：
植物乳杆菌培养基：葡萄糖4%，kh2po40.2%，蛋白胨1%，酵母膏0.4%，ph6.2，植物乳杆菌接种量为1~2%；
短乳杆菌培养基：葡萄糖2%，麦芽糖2%，kh2po40.2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.8%，ph6.5，短乳杆菌接种量为1~2%；
赖氏乳杆菌培养基：葡萄糖2%，蔗糖2%，kh2po40.2%，蛋白胨0.4%，酵母膏0.8%，ph6.5，赖氏乳杆菌接种量为1~2%；
乳酸片球菌培养基：葡萄糖2%，蔗糖1%，麦芽糖1%，kh2po40.2%，蛋白胨1%，酵母膏0.6%，ph6.5，赖氏乳杆菌接种量为1~2%。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，步骤（1）中碳源包括重量百分比均为2~4%的葡萄糖、麦芽糖和蔗糖；氮源包括重量百分比均为0.4~1%的蛋白胨和酵母膏。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，步骤（2）中富集条件分别为：
植物乳杆菌富集条件为：ph6.2，温度30℃，160r/min摇动培养；
短乳杆菌富集条件为：ph6.5，温度30~35℃，160r/min摇动培养；
赖氏乳杆菌富集条件为：ph6.5，温度30~35℃，静止培养；
乳酸片球菌富集条件为：ph6.5，温度35℃，静止培养。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，步骤（3）中浓缩条件分别为：
植物乳杆菌浓缩条件为：6000r/min，10min；
短乳杆菌浓缩条件为：8000r/min，15min；
赖氏乳杆菌浓缩条件为：8000r/min，20min；
乳酸片球菌浓缩条件为：8000r/min，10min；
浓缩后四株菌沉淀得率分别为：植物乳杆菌25%；短乳杆菌19%；赖氏乳杆菌15%；乳酸片球菌16%。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，步骤（4）中冻干保护剂配制中脱脂乳、甘油、麦芽糖质量百分比为：植物乳杆菌、短乳杆菌为14%脱脂乳+6%甘油+10%麦芽糖；赖氏乳杆菌为15%脱脂乳+5%甘油+15%麦芽糖；乳酸片球菌为12%脱脂乳+8%甘油+10%麦芽糖。
上述高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备方法，所述复合菌剂的冻干菌粉直接以0.3‰添加量投入生产；或者所述复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基30℃过夜培养后，以2%液态形式投入生产。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明复合菌剂可高效降解酸菜中亚硝酸盐，安全，无副作用，经测定其菌数均≥1010cfu/g，复合菌剂发酵降解亚硝酸盐≥98.5％，加入本发明复合菌剂后，在10℃发酵100斤白菜18天成熟，22℃发酵100斤白菜6天成熟，30℃发酵100斤白菜3天成熟，这与传统发酵工艺相比，极大的缩短了酸菜的发酵周期，有效降低酸菜发酵过程中产生的亚硝酸钠，保证酸菜发酵风味的同时显著提高了酸菜安全性，品质优良，应用前景广泛。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例中所用植物乳杆菌、短乳杆菌、赖氏乳杆菌、乳酸片球菌均由大连大学（辽宁省海洋微生物工程技术研究中心）实验室保藏，也可以通过商业渠道购买获得。
高效降解酸菜中亚硝酸盐的复合菌剂的制备：
（1）选取本实验室保藏的植物乳杆菌、短乳杆菌、赖氏乳杆菌、乳酸片球菌，将上述四株菌在基础培养基上添加2~5%w/v碳源和0.2~0.6%w/v氮源构成富集培养基，30~35℃培养40h。以菌数为参照指标。富集培养基为：
植物乳杆菌培养基：葡萄糖4g，kh2po40.2g，蛋白胨1g，酵母膏0.4g，100ml蒸馏水，ph6.2，植物乳杆菌接种量为1~2ml；
短乳杆菌培养基：葡萄糖2g，麦芽糖2g，kh2po40.2g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.8g，ph6.5，短乳杆菌接种量为1~2ml；
赖氏乳杆菌培养基：葡萄糖2g，蔗糖2g，kh2po40.2g，蛋白胨0.4g，酵母膏0.8g，ph6.5，赖氏乳杆菌接种量为1~2ml；
乳酸片球菌培养基：葡萄糖2g，蔗糖1g，麦芽糖1g，kh2po40.2g，蛋白胨1g，酵母膏0.6g，100ml蒸馏水，ph6.5，赖氏乳杆菌接种量为1~2ml。
（2）富集条件：在上述优化基础上优化生长条件，ph6.0~6.5，温度28~35℃，采用静止和摇动培养方式。以菌数为参照指标。富集条件为：
植物乳杆菌：ph6.2，温度30℃，160r/min摇动培养；
短乳杆菌：ph6.5，温度30~35℃，160r/min摇动培养；
赖氏乳杆菌：ph6.5，温度30~35℃，静止培养；
乳酸片球菌：ph6.5，温度35℃，静止培养。
（3）浓缩条件：在增菌后菌体液的基础上，通过4000~8000r/min，10~20min条件下离心浓缩富集的菌体。以菌数为参照指标。浓缩条件为：
植物乳杆菌6000r/min，10min；
短乳杆菌8000r/min，15min；
赖氏乳杆菌8000r/min，20min；
乳酸片球菌8000r/min，10min。
浓缩后四株菌沉淀得率分别为：植物乳杆菌25%；短乳杆菌19%；赖氏乳杆菌15%；乳酸片球菌16%。
（4）菌株冻干：将浓缩后的菌体分别与冻干保护剂v/v=1:1混合，置于冻干机内冻干得到植物乳杆菌的冻干菌粉、短乳杆菌的冻干菌粉、赖氏乳杆菌的冻干菌粉，乳酸片球菌的冻干菌粉；
所述的100g冻干保护剂配制中脱脂乳、甘油、麦芽糖的质量分别为：植物乳杆菌、短乳杆菌为14g脱脂乳+6g甘油+10g麦芽糖；赖氏乳杆菌为15g脱脂乳+5g甘油+15g麦芽糖；乳酸片球菌为12g脱脂乳+8g甘油+10g麦芽糖。
（5）菌株配比：将上述四株菌进行等质量配比，即植物乳杆菌：短乳杆菌：赖氏乳杆菌：乳酸片球菌=1:1:1:1，即得所需复合菌剂，其亚硝酸盐降解率≥97.3%，且风味与感官评价皆为优良。
本发明的复合菌剂的冻干菌粉可直接以0.3‰添加量投入生产、0.1‰接种量在基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式投入生产。
实施例1
将100斤大白菜洗净沥干后，加入0.3‰的本发明复合菌剂的冻干菌粉，22℃发酵6天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为99.1%。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，22℃发酵6天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为43.1%。
实施例2
将100斤大白菜洗净沥干后，加入0.3‰的本发明复合菌剂的冻干菌粉，10℃发酵18天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为98.8%。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，10℃发酵18天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为56.3%。
实施例3
将100斤大白菜洗净沥干后，加入0.3‰的本发明复合菌剂的冻干菌粉，30℃发酵3天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为99.5%。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，30℃发酵3天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为39.5%。
实施例4
将100斤大白菜洗净沥干后，加入0.3‰的本发明复合菌剂的冻干菌粉，22℃发酵6天，成熟。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，22℃发酵15天，成熟。
实施例5
将100斤大白菜洗净沥干后，加入0.3‰的本发明复合菌剂的冻干菌粉，10℃发酵18天，成熟。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，10℃发酵40天，成熟。
实施例6
将100斤大白菜洗净沥干后，加入0.3‰的本发明复合菌剂的冻干菌粉，30℃发酵3天，成熟。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，30℃发酵8天，成熟。
实施例7
将本发明复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式加入到100斤洗净沥干的大白菜中，22℃发酵6天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为97.9%。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，22℃发酵6天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为41.7%。
实施例8
将本发明复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式加入到100斤洗净沥干的大白菜中，10℃发酵18天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为97.3%。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，10℃发酵18天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为55.1%。
实施例9
将本发明复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式加入到100斤洗净沥干的大白菜中，30℃发酵3天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为98.5%。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，30℃发酵3天，测定酸菜汤汁中亚硝酸盐降解率为38.7%。
实施例10
将本发明复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式加入到100斤洗净沥干的大白菜中，22℃发酵7天，成熟。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，22℃发酵16天，成熟。
实施例11
将本发明复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式加入到100斤洗净沥干的大白菜中，10℃发酵19天，成熟。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，10℃发酵42天，成熟。
实施例12
将本发明复合菌剂的冻干菌粉以0.1‰接种量在细菌基础培养基中30℃过夜培养后，以2%液态形式加入到100斤洗净沥干的大白菜中，30℃发酵4天，成熟。
将100斤大白菜洗净沥干后，不加冻干菌粉，30℃发酵9天，成熟。