本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法。
背景技术：
3-羟基丙酸是三碳、无手性有机酸，与乳酸互为同分异构体。3-羟基丙酸具有羟基和羧基两个官能团，是很多光学活性物质的前体。它脱水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，还原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一种重要的化工平台产品。2004年美国能源部将其列为当今世界12种最具潜力的化工产品之一。
目前，3-羟基丙酸的生产方法是化学合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯睛转化法。但在碳末端引入功能团有很大的难度，且其产品不易分离提纯，生产成本较高，生产过程存在不安全因素，而利用微生物发酵生产3-羟基丙酸可以有效地避免这些不利因素。微生物转化法生产3-羟基丙酸的研究始于20世纪60年代，但一直处于实验室阶段，主要包括构建基因工程菌法和野生菌发酵法。基因工程法生产3-羟基丙酸有两条途径：以葡萄糖为底物和以甘油为底物的生物转化路线。其中，北京工商大学的王凤寰等人通过在肺炎克雷伯杆菌(k.pneumonia)中表达来自酿酒酵母的乙醛脱氢酶(aldh)，得到了一株能同时利用甘油耦连生产3-羟基丙酸和1，3-丙二醇的重组菌，其3-羟基丙酸的产量为5g/l。已知的可发酵生产3-羟基丙酸的野生菌株主要有：han-senulamiso、fusariummerismoides、candidarugosa、byssochlamyssp.、rhodococcuserythropolislg12和klebsiellaterrigena。其中，李冰和裴疆森从自然坏境中筛选可代谢产生3-羟基丙酸的微生物菌株土生克雷伯氏菌(klebsiellaterrigena)可以以甘油为唯一碳源生产3-羟基丙酸，产酸能力为1%(10g/l)，初次实现野生菌种从甘油直接装化生成3-羟基丙酸。
目前，国内外研究的3-羟基丙酸生产方法多为构建基因工程菌法，微生物发酵生产3-羟基丙酸的实际应用还很少。为此提出一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法。
技术实现要素：
本发明提出的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，包括以下步骤：
步骤1、出发菌株的选择：选用假丝酵母变种作为出发菌株；
步骤2、菌株的活化：将所述出发菌株接入活化培养基中，37℃，150-165r/min摇床培养24-36h，然后将培养液涂布到筛选培养基上，35-42℃，培养36-48h，挑取单菌落，重复活化操作，进行二次活化，得到二次活化的酵母菌液；
步骤3、菌株的多重诱变：
氯化锂诱变：分别配制氯化锂浓度为0%、o.3%、0.5%、0.7%.0.9%、和1%的活化培养基取1ml二次活化的酵母菌液分别接入不同浓度的氯化锂活化培养基中，35-42℃，135r/min摇床培养24h；
紫外诱变：然后取菌悬液8ml置于直径9cm的培养皿中，在磁力搅拌下用15w紫外灯照射30s、60s、90s、120s；
亚硝基胍诱变：称取亚硝基胍放入无菌离心管中，加入浓度为1011个/ml的菌悬液，使亚硝基胍终浓度为0.5mg/ml，充分溶解后置于35-38℃恒温振荡，作用时间分别为15min、25min、35min、45min；
步骤4、诱变菌株的筛选：
将步骤3所得到的右边之后的菌悬液分别梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后，取不同浓度的菌悬液200μl涂布至筛选培养基上，30-40℃培养48-72h，挑选透明圈与菌落直径比值较大的单菌落进行保存；
步骤5、诱变菌株的复筛：
将步骤4所筛选的诱变菌株涂布于基础培养基中，28-33.2℃，恒温水浴震荡培养24-36h，通过测定发酵液中丙酸的含量确定筛选的菌株。
优选的，所述假丝酵母变种(candidasp.)，于2011年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.5344。
优选的，所述活化培养基的组成为：葡萄糖20.00g，酵母浸膏10.00g，蛋白胨20.00g，琼脂粉20.00g，无菌水1000ml。
优选的，所述氯化锂活化培养基为所述活化培养基中加入不同浓度的氯化锂。
优选的，所述筛选培养基的组成成分为：葡萄糖20.00g，酵母浸膏、10.00g，(nh4)2so4、10.00g，kh2po4、5.00g，k2hpo4、2.00g，mgso4·7h20、1.00g，feso4·7h20、0.03g，丙酸、2.00g，琼脂粉、20.00g，无菌水、1000ml。
优选的，所述基础培养基的组成成分为：蛋白胨10.00g、蔗糖20.00g、酵母膏10.00g、(nh4)3po45.00g，无菌水、1000ml。
优选的，所述活化培养基、筛选培养基、基础培养基的ph均为7.0-7.5。
本发明提出的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，有益效果在于：本发明以假丝酵母变种为出发菌株，复合诱变得到可稳定遗传的高产菌株，其生产量明显高于目前的报道，为微生物发酵生产3-羟基丙酸工业化提供了可能。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，包括以下步骤：
步骤1、出发菌株的选择：选用假丝酵母变种作为出发菌株；
步骤2、菌株的活化：将出发菌株接入活化培养基中，37℃，150-165r/min摇床培养24-36h，然后将培养液涂布到筛选培养基上，35-42℃，培养36-48h，挑取单菌落，重复活化操作，进行二次活化，得到二次活化的酵母菌液；
步骤3、菌株的多重诱变：
氯化锂诱变：分别配制氯化锂浓度为0%、o.3%、0.5%、0.7%.0.9%、和1%的活化培养基取1ml二次活化的酵母菌液分别接入不同浓度的氯化锂活化培养基中，35-42℃，135r/min摇床培养24h；
紫外诱变：然后取菌悬液8ml置于直径9cm的培养皿中，在磁力搅拌下用15w紫外灯照射30s、60s、90s、120s；
亚硝基胍诱变：称取亚硝基胍放入无菌离心管中，加入浓度为1011个/ml的菌悬液，使亚硝基胍终浓度为0.5mg/ml，充分溶解后置于35-38℃恒温振荡，作用时间分别为15min、25min、35min、45min；
步骤4、诱变菌株的筛选：
将步骤3所得到的右边之后的菌悬液分别梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后，取不同浓度的菌悬液200μl涂布至筛选培养基上，30-40℃培养48-72h，挑选透明圈与菌落直径比值较大的单菌落进行保存；
步骤5、诱变菌株的复筛：
将步骤4所筛选的诱变菌株涂布于基础培养基中，28-33.2℃，恒温水浴震荡培养24-36h，通过测定发酵液中丙酸的含量确定筛选的菌株。
其中，假丝酵母变种(candidasp.)，于2011年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.5344。
其中，活化培养基的组成为：葡萄糖20.00g，酵母浸膏10.00g，蛋白胨20.00g，琼脂粉20.00g，无菌水1000ml。
其中，氯化锂活化培养基为活化培养基中加入不同浓度的氯化锂。
其中，筛选培养基的组成成分为：葡萄糖20.00g，酵母浸膏、10.00g，(nh4)2so4、10.00g，kh2po4、5.00g，k2hpo4、2.00g，mgso4·7h20、1.00g，feso4·7h20、0.03g，丙酸、2.00g，琼脂粉、20.00g，无菌水、1000ml。
其中，基础培养基的组成成分为：蛋白胨10.00g、蔗糖20.00g、酵母膏10.00g、(nh4)3po45.00g，无菌水、1000ml。
其中，活化培养基、筛选培养基、基础培养基的ph均为7.0-7.5。
将按照上述方法诱变筛选得到的高产菌株，每隔7d进行斜面转接一次，30℃，180r/min摇床培养36h，然后利用气相色谱法检测丙酸的含量；共传10代，每代做3个平行样，选用第一代、第三代、第五代、第七代、第十代作为样品检测。具体结果见表1。
气相色谱法检测丙酸的步骤为：用gc一7890i气相色谱仪测定丙酸含量，不锈钢色谱柱，gdx-401固定相，色谱柱温度：200℃，进样气温度：220℃，检测器温度：220℃，进样量1μl，外标法测定。
样品处理：取1ml发酵液于ep管中，加人0.02ml50%h2so4，酸化，10000r/min离心3min，取上清液测定3-羟基丙酸的含量。
表1：
注：标号为0的检测样品均为出发菌以及出发菌的传代培养菌。
结果表明，经过本发明提供的诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法进行筛选出的诱变菌株具有较高的产3-羟基丙酸的能力，且具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产推广。
本发明以假丝酵母变种为出发菌株，复合诱变得到可稳定遗传的高产菌株，其生产量明显高于目前的报道，为微生物发酵生产3-羟基丙酸工业化提供了可能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。