一种重组菌及其在检测结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组菌及其在检测结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性中的应用。

背景技术：

结核菌药物敏感性的准确、快速分析，是临床及时制定适当化疗方案的前提条件，是制约结核病及时有效治疗的瓶颈之一。科学家们为此进行了不懈努力，但迄今为止，结核菌临床药敏分析仍然停留在耗时的基于结核菌培养的传统药敏分析方法，尽管随着分子生物学技术的进步，科学家们开发了多种分子生物学分析手段，但这些貌似先进的手段在准确性方面先天性不足，目前还没有迹象表明它们能够代替传统的分析方法。

bactecmgit960全自动培养系统是集分枝杆菌快速生长培养、检测、药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪，具有无交叉污染、无放射、连续监测标、准确的数据处理系统等优点，能快速、敏感、高效的分析分枝杆菌对药物的耐药结果，缩短了报告结果时间，但其仪器耗材昂贵，成本高，短时间很难大范围推广，特别是基层医疗单位更难以推广。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，为抑制或降低大肠杆菌中pnca基因和nadc基因的表达或活性，且提高所述大肠杆菌中碱性磷酸酶基因的表达或活性，得到重组菌。

上述方法中，所述抑制或降低大肠杆菌中pnca基因和nadc基因的表达或活性为敲除大肠杆菌中的pnca基因和nadc基因；

所述提高大肠杆菌中碱性磷酸酶基因的表达或活性为将碱性磷酸酶基因导入所述大肠杆菌中。

上述方法中，所述敲除是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为zfn编辑、talen编辑或crispr/cas9编辑；

或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacb基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组；具体方法见实施例。

或所述导入是通过表达碱性磷酸酶基因的重组载体导入。

上述方法中，所述碱性磷酸酶基因来自大肠杆菌。

上述方法中，所述pnca蛋白的氨基酸序列为序列4；

或，所述nadc蛋白的氨基酸序列为序列2；

或，所述碱性磷酸酶的氨基酸序列为序列6；

或，所述pnca基因的核苷酸序列为序列3；

或，所述nadc基因的核苷酸序列为序列1；

或，所述碱性磷酸酶基因的核苷酸序列为序列5。

上述方法中，

所述敲除大肠杆菌基因组中的pnca基因采用λ-red同源重组方式；

或，所述敲除大肠杆菌基因组中的nadc基因采用λ-red同源重组方式；

或，所述表达碱性磷酸酶基因的重组载体为将碱性磷酸酶基因eap插入表达载体，得到重组质粒。

上述方法中，

所述大肠杆菌为e.coliw3110。

由上述的方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组菌在检测待测结核菌对药物的敏感性中的应用也是本发明保护的范围；

或上述重组菌在检测待测结核菌是否为耐药菌株中的应用也是本发明保护的范围；

或上述重组菌在制备检测待测结核菌对药物的敏感性产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还提供了一种检测或辅助检测待测结核菌对药物的敏感性方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将上述重组菌在不含烟酸的培养基中饥饿处理(饥饿处理的目的是将菌体内残存的部分烟酸及相关代谢物消耗干净)，得到饥饿处理后重组菌；

2)将待测结核菌、药物和上述重组菌，共培养，碱性磷酸酶显色检测，

若待测结核杆菌显蓝紫色，则待测结核菌对该药物耐药或候选耐药；

若待测结核杆菌不显蓝紫色，则待测结核菌对该药物敏感或候选敏感。

上述中，所述药物为利福平、异烟肼、链霉素或乙胺丁醇等。

所述耐药菌株为利福平和/或异烟肼菌株。

本发明具有如下优点：

1、结核菌在体外生长的过程中，会特异性的分泌烟酸。通过对大肠杆菌nad代谢途径的改造，获得大肠杆菌，用于结核菌培养物中烟酸的快速分析，从而实现结核菌药物敏感性的准确和快速分析，提高传统药敏检测的灵敏度，缩短检测时间。

2、同时，可以通过分析添加其它抗结核药物之后结核菌烟酸的分泌情况，来判断药物对结核菌的抑制情况。

3、为了进一步优化检测方法，向nad营养缺陷型菌株中引入了一个碱性磷酸酶(eap)的表达质粒，利用eap显色原理来检测共培养体系内大肠杆菌的生长状态，颜色反应方法在保证检测效果的前提下，肉眼即可判读样品对抗结核药物的耐药性，操作更为简便。

附图说明

图1为基于人工合成菌株的药敏分析方法的方法学验证和初步优化。

图2为碱性磷酸酶显色法灵敏度检测。

图3为e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap的eap显色法检测m.tuberculosish37ra对inh、rif的敏感性。

图4为e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap的eap显色法检测m.tuberculosish37ra，m.tuberculosish37rainh(异烟肼耐药株)和m.tuberculosish37rarif(利福平耐药株)对药物的敏感性。

图5为基于e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap的eap显色方法对临床结核分枝杆菌进行药敏性分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用的原理：

利用结核菌在生长过程中特异性的分泌烟酸的原理，采用合成生物学方法，通过对大肠杆菌nad代谢途径的改造，获得大肠杆菌烟酸依赖性营养缺陷型菌株，并将大肠杆菌碱性磷酸酶转入该菌株，用于结核菌培养物中烟酸的快速分析，从而实现结核菌药物敏感性的准确和快速分析，缩短药敏分析时间，促进耐药性结核病的防治。

结核菌在生长过程中特异性的分泌烟酸。烟酸的分泌可以作为结核菌生长的指标，可以通过监测烟酸的分泌情况，判断药物对结核菌的抑制情况；基于上述原理，采用合成生物学研究手段，首先通过对大肠杆菌nad合成途径进行改造，构建nad营养缺陷型，该营养缺陷型只有在外界提供额外的nad代谢产物(如烟酸)的前提下才能生长。

随后，采用大肠杆菌烟酸依赖性营养缺陷型菌株，并将大肠杆菌碱性磷酸酶转入该菌株，通过对药物处理后结核菌的烟酸分泌情况的比较分析，判断结核菌对药物的敏感性情况。

实施例1、重组菌e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap的构建

一、所需引物的设计

设计用于同源重组的引物，上下游引物的5’端均为50bp的nadc或pnca的同源臂，上下游引物的3’端均为20bp的用于扩增卡那霉素抗性基因的引物(两侧有frt位点)。

同时还设计敲除菌的鉴定引物(在同源臂的外侧)。所用到的敲除引物以及鉴定引物见表1。

表1本发明所涉及的引物

二、重组菌e.coliw3110(δnadc)的构建

1、中间菌e.coliw3110-pkd46的制备

将质粒pkd46(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000,97(12):6640-6645)转入大肠杆菌e.coliw3110中，得到中间菌e.coliw3110-pkd46。

2、重组菌e.coliw3110(δnadc)的构建

运用基因敲除技术，将nad从头合成途径(denovosynthesis)中的关键酶nadc敲除，从而阻断细菌的nad从头合成，获得nad营养缺陷型菌株e.coliw3110(δnadc)；在nadc基因敲除的基础上，进一步敲除大肠杆菌nad回收途径(salvagepathway)中的尼克酰胺酶基因pnca，获得双重敲除nad营养缺陷型菌株e.coliw3110(δnadcδpnca)，具体如下：

用质粒pkd4(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000,97(12):6640-6645)为模板，以表1中的nadc-1s/nadc-2a引物进行pcr扩增，得到约1800bp的内部带有卡那霉素抗性(km)筛选标记、两端为nadc基因同源序列的线性片段。

将上述扩增得到的线性片段用dpnⅰ内切酶37℃作用2h，得到酶切产物，再将酶切产物电转化至e.coliw3110-pkd46感受态细胞中，电击之后的菌液涂步于卡那抗性的lb培养基平板上，过夜培养后挑取长出的菌斑至带卡那霉素的液体lb培养基中，再用表1的敲除鉴定引物nadc-check-s/nadc-check-a做pcr，得到1800bp为卡那霉素抗性基因替换nadc基因的重组菌。将该重组菌42℃培养，得到消除质粒pkd46且nadc基因被替换的菌株，命名为e.coliw3110δnadc：：km。

再温度敏感型质粒pcp20(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000,97(12):6640-6645)导入e.coliw3110δnadc：：km细胞中，在含氨苄青霉素和卡那霉素的平板上筛选阳性转化子。在该过程中，pcp20表达flp重组酶，后者识别卡那抗性基因两边的frt位点，从而激发flp重组的发生，使两个frt位点之间的卡那抗性基因丢失。随后，将该阳性转化子于42℃培养，得到消除质粒pcp20且消除卡那抗性基因的克隆子，命名为在e.coliw3110(δnadc)。

重组菌e.coliw3110(δnadc)为敲除大肠杆菌e.coliw3110基因组中的nadc基因得到的菌。

三、e.coliw3110(δnadcδpnca)菌株构建

1、中间菌e.coliw3110(δnadc)-pkd46的制备

将温度敏感型质粒pkd46转入大肠杆菌e.coliw3110(δnadc)中，得到中间菌e.coliw3110(δnadc)-pkd46。

2、重组菌e.coliw3110(δnadcδpnca)的构建

用质粒pkd4为模板，以表1中的pnca-1s、pnca-2a引物进行pcr扩增，得到约1800bp的内部带有卡那霉素抗性(km)筛选标记、两端为pnca基因同源序列的线性片段。

将上述扩增得到的卡那基因用dpnⅰ内切酶37℃作用2h，得到酶切产物，再将酶切产物电转化至重组菌e.coliw3110(δnadc)感受态细胞中，电击之后的菌液涂步于卡那抗性的lb培养基平板上，过夜培养后挑取长出的菌斑至带卡那霉素的液体lb培养基中，再用表1中的敲除鉴定引物pnca-check-s、pnca-check-a做pcr，得到1800bp为km替换pnca基因得到的重组菌。将该重组菌42℃培养，得到消除质粒pkd46且nadc基因被替换的菌株，命名为e.coliw3110(δnadc)δpnca：：km。

再将温度敏感型质粒pcp20导入e.coliw3110(δnadc)δpnca：：km细胞中，在含氨苄青霉素和卡那霉素的平板上筛选阳性转化子。在该过程中，pcp20表达flp重组酶，后者识别卡那抗性基因两边的frt位点，从而激发flp重组的发生，使两个frt位点之间的卡那抗性基因丢失。随后，将该阳性转化子于42℃培养，得到消除质粒pcp20且消除卡那抗性基因的克隆子，命名为在e.coliw3110(δnadcδpnca)。

重组菌e.coliw3110(δnadcδpnca)为敲除大肠杆菌e.coliw3110基因组中的nadc基因和pnca基因，得到的菌。

四、e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap菌株构建

重组质粒pask75-eap：碱性磷酸酶基因eap替换pask75质粒(biovectorntcc质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心,pask75vector)的xbaⅰ和hindⅲ酶切位点间的片段，得到重组质粒pask75-eap。

将重组质粒pask75-eap转入上述三制备的重组菌e.coliw3110(δpncaδnadc)感受态细胞中，在带有amp抗性lb平板上挑取单克隆提前质粒，进行酶切验证(xbaⅰ和hindⅲ酶切)，得到1600bp的片段，将验证正确的克隆子送至公司测序。将测序正确的阳性克隆子，命名为e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap。

实施例2、e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap在分析结核菌的药物敏感性中的应用

一、e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap饥饿处理过程

将实施例1制备的重组菌e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap菌液接种于新鲜的lb(kan⁺)液体培养基中。37℃震荡培养，待菌液长至od600＝1.0左右之后，在带卡那霉素抗性的lb平板上划线，37℃恒温箱中过夜培养，挑取单克隆接种于新鲜lb(kan⁺)液体培养基中。当菌液浓度长至0.6-1.0时，超净台中吸取1ml菌液于无菌ep管中，6,000rpm，5min离心弃上清，用新鲜7h9培养基洗涤菌体3次，然后用300μl新鲜7h9培养基悬浮菌体，接种于5ml带卡那霉素的7h9培养基(不含有烟酸)中饥饿处理48h，消耗完全大肠杆菌胞内的烟酸，得到饥饿处理后e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap。

二、碱性磷酸酶(eap)显色法用于m.tuberculosish37ra野生菌株灵敏度分析

1)基于人工合成菌株的药敏分析方法的方法学验证和初步优化

将液体培养的结核分枝杆菌h37ra，以新鲜7h9培养基洗涤两次，并稀释到约5x10⁵细菌/毫升菌液，并加入不同浓度的异烟肼进行处理；1-6为异烟肼给药浓度梯度，依次为0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32μg/ml(异烟肼对h37ra的mic为0.06μg/ml)；异烟肼处理后取样时间：a，0天；b，1天；c，2天；d,3天。

结果如图1所示，h37ra与w3110(△pnca△nadc)共培养时间为10h,bcip/nbt显色反应时间为8h(d的反应可以缩短到一个小时)；图中所示结果与预期相符，初步验证此方法是合理可行的。同时，如图所示菌液预培养3天，显色一个小时能得到最清晰的实验结果。(也是后面实验所用的条件)

2)碱性磷酸酶(eap)显色法用于m.tuberculosish37ra野生菌株灵敏度分析在结核分枝杆菌m.tuberculosish37ra液体培养到od600＝0.6-1.0时，用新鲜7h9+oadc洗涤三次后悬浮菌体至od600＝1，洗涤后重新接种的m.tuberculosish37ra进行菌液梯度稀释(稀释液为7h9培养基，母液菌浓度设定为od600＝0.1(1×10⁷cfu/ml))，稀释后再培养3天；将饥饿处理后的e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap用7h9培养基稀释至10⁸cfu/ml，按1％的比例加入至培养3天后的m.tuberculosish37ra菌液中，于恒温震荡摇床中160rpm，37℃共培养5h，加入终浓度0.2％(m/v)的诱导剂四环素(tetracyclin,tet)，150rpm，37℃，共培养时间为8h。然后每组取样100μl在96孔板中，加入1.5μl碱性磷酸酶显色液避光37℃静置，60min后拍照，检测大肠杆菌的生长状态。

结果如图2所示，c:control,1-7:m.tuberculosish37racfu＝10⁷-10⁰，可以看出，该检测方法对m.tuberculosish37ra菌浓度的检测限为10⁵-10⁴cfu/ml，满足临床实施结核分枝杆菌药敏分析的检测灵敏度要求，同时稳定的检测周期为3天，大大短于传统的结核分枝杆菌药敏性检测周期。

三、碱性磷酸酶显色法检测m.tuberculosish37ra野生菌株对药物灵敏度

在m.tuberculosish37ra长到od600＝0.6-1.0时，取菌液4,000rpm，10min离心去上清，用新鲜7h9+oadc洗涤三次后悬浮菌体至od600＝0.1，得到m.tuberculosish37ra菌液；然后加入不同浓度的利福平(rif)和异烟肼(inh)，三天后每组菌液取样450μl与饥饿处理48h后用7h9培养基稀释至10⁷cfu/ml的e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap菌液50μl在恒温摇床上160rpm、37℃共培养5h，再加入终浓度为0.2％(m/v)的诱导剂四环素(tetr)，150rpm，37℃，共培养时间为8h。然后每组取样100μl在96孔板中，加入1.5μl碱性磷酸酶(eap)显色液避光37℃静置，60min后拍照。

结果如图3所示，异烟肼浓度:1,空白对照；2,不加药；3-6,0.02,0.04,0.08,0.16(μg/ml)；利福平浓度:1,空白对照；2,不加药；3-6:0.002,0.004,0.008,0.016(μg/ml)，与阳性对照组相比，随着inh和rif给药浓度的升高，eap颜色反应的蓝色逐渐减弱，基于肉眼可见显蓝色的eap检测法用于e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap检测m.tuberculosish37ra的生长状态的着明显的优势，这意味着更简便的实验操作以及更低廉的检测成本。上述结果表明，e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap菌株可用于肉眼检测m.tuberculosish37ra野生菌株对药物灵敏度。

四、碱性磷酸酶显色法用于m.tuberculosish37ra耐药性菌株的检测

1)结核分枝杆菌自发突变耐药菌株筛选

(1)m.tuberculosish37ra在新鲜7h9+oadc培养基中培养至od600＝0.6～0.8，室温用4,000rpm离心15min，去掉上清；

(2)用等体积的新鲜的7h9+oadc培养基悬浮细胞，室温用4,000rpm离心15min，去掉上清；

(3)用新鲜的7h9+oadc培养基悬浮细胞，调整细胞的浓度到10⁸cfu/ml；

(4)取200μl的浓缩后的菌液涂布在预先配制的含有不同浓度的rif(0.5、1和5μg/ml)以及inh(0.1、1、2μg/ml)的7h10+oadc固体培养基平板；

(5)把平板置于37℃培养箱培养大约3-4周；

(6)挑取在含rif或inh的固体平板上长出来的单菌落到10ml的7h9+oadc培养基，37℃培养箱培养大约2-3周，得到耐rif的m.tuberculosish37ra和耐inh的m.tuberculosish37ra这2种耐药性菌株。

2)碱性磷酸酶显色法用于m.tuberculosish37ra耐药性菌株的检测

将上述耐rif的m.tuberculosish37ra和耐inh的m.tuberculosish37ra分别于10ml新鲜7h9+oadc培养基中培养，待其长到od600＝0.6-1.0时，取菌液4,000rpm，10min离心去上清，用新鲜7h9+oadc洗涤三次后悬浮菌体至od600＝0.1，然后用终浓度为1μg/ml的rif和10μg/ml的inh分别处理相应的m.tuberculosish37ra耐药株，三天后每组菌液取样450μl与饥饿处理48h后用7h9培养基稀释至10⁷cfu/ml的e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap菌液50μl在恒温摇床上160rpm、37℃共培养5h，再加入终浓度为0.2％(m/v)的诱导剂四环素(tetr)，150rpm，37℃，共培养时间为8h。然后每组取样100μl在96孔板中，加入1.5μl碱性磷酸酶显色液避光37℃静置，60min后拍照。

结果如图4所示，1,blank,e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap；2,m.tuberculosish37ra+e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap；3,m.tuberculosish37ra^rif+e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap+rif；4,m.tuberculosish37ra^inh+e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap+inh；5,m.tuberculosish37ra+e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap+rif；6,m.tuberculosish37ra+e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap+inh；inh:2μg/ml,rif:1μg/ml；用远高于m.tuberculosish37ra野生型菌株链霉素及利福平mic的药物浓度处理m.tuberculosish37ra和筛选出来的相应耐药株之后，对于利福平和异烟肼给药组，eap颜色反应检测出来的结果对敏感株和耐药株的区分非常明显，m.tuberculosish37ra^rif和m.tuberculosish37ra^inh因其对利福平或异烟肼的耐药性，生长不受到药物的影响，因此烟酸大量积累，eap显色检测响应强烈。上述结果表明，可以证明e.coliw3110(δpncaδnadc)/pask75-eap菌株的确能够区分出耐药菌株和野生型菌株。

实施例4、e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap用于临床结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性检测

从斜面培养基将6株临床结核分枝杆菌菌株(编号为f1-f6)刮至7h9+oadc培养基中，待菌长起之后每株菌分别按5％的接种量转接到10ml新鲜7h9+oadc培养基中37℃恒温培养箱中静置培养，当菌液长至od600＝0.6左右时，4,000rpm，10min离心，分别将菌体用新鲜7h9+oadc洗涤三次然后用10ml培养基悬浮，从中取1ml菌液转接至3瓶9ml新鲜7h9+oadc培养基中，一组加入终浓度为40μg/ml的利福平水溶液，一组加入终浓度为0.2μg/ml的异烟肼水溶液，一组为对照组加入等体积的dmso，置于37℃恒温培养箱中3天后于24孔板中每组取450μl的菌液与50μl饥饿48h的e.coliw3110(δnadcδpnca)/pask75-eap共培养8h，然后每孔加入7.5μl的碱性磷酸酶显色液避光37℃静置，60min之后拍照。

结果如图5所示，strainc:control,n:nodrug,i:inh,r:rif；表明f1菌株有利福平耐药性，异烟肼敏感；f2、f7、f9、f10有明显异烟肼耐药对利福平敏感，f8为利福平和异烟肼的多重耐药菌株。

临床结核分枝杆菌菌株(编号为f1-f6)进行基于罗氏固体培养基的比例法药敏试验，结果发现的确f1菌株有利福平耐药性，异烟肼敏感；f2、f7、f9、f10有明显异烟肼耐药对利福平敏感，f8为利福平和异烟肼的多重耐药菌株。

序列表

<110>中国科学院武汉病毒研究所广东体必康生物科技有限公司

<120>一种重组菌及其在检测结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性中的应用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>894

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<211>297

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

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151015

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leuleuprogluasnserargserhisalathrvalilethrargglu

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100105110

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115120125

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165170175

leuglyleuseraspalapheleuilelysgluasnhisileileala

180185190

serglyservalargglnalavalglulysalasertrpleuhispro

195200205

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