YTHDF2基因在尿路上皮癌诊断、预防和治疗中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及ythdf2基因在尿路上皮癌诊断、预防和治疗中的应用。

背景技术：

尿路上皮癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一，在我国，尿路上皮癌高居中国男性泌尿系统恶性肿瘤发病率首位。较高发病率和术后易复发是尿路上皮癌的两个主要特点，但目前关于尿路上皮癌的发病和复发机制尚不明确。尿路上皮癌可分为非肌层浸润型尿路上皮癌（nmibc）和肌层浸润型尿路上皮癌（mibc）。75%的患者初次诊断为nmibc，只有不到25%的患者为mibc。目前治疗尿路上皮癌的主要方法是经尿道膀胱肿瘤切除术（turbt），对于低级别的肿瘤，手术切除后可通过滴注丝裂霉素c等化疗药物以延缓疾病复发，然后定期进行膀胱镜检查和尿沉渣的细胞学检测。若检测到多种或更高级别的肿瘤时，可以采用bcg灌注方式治疗。而对于恶性程度更高的mibc，则主要采取电切加化疗或放疗的方法医治，病人的五年生存期约为50%，当肿瘤发生恶性转移时，五年期生存率仅为5％。目前评估复发和进展的风险以及相应疗法的决策主要依赖于肿瘤大小、病理分级、和多灶性等指标，没有明确的分子生物标志物。尽管尿路上皮癌的致死率小于其他肿瘤，但由于其术后易复发，病人需要通过膀胱镜进行长期疾病监测和反复治疗复发性疾病，严重影响了患者的晚年生活质量，加重了患者的家庭经济负担。因此，亟需开发新的肿瘤标志物和治愈疗法。

n6-腺苷酸甲基化（m6a）是真核生物mrna和lncrna上发生的最普遍的可逆化学修饰。哺乳动物rna的腺嘌呤大约0.1-0.4%会发生该化学修饰。参与m6a修饰的蛋白主要有三类:甲基转移酶、去甲基化酶和m6a结合蛋白。最近研究表明，由m6a修饰相关酶的异常表达导致的m6a修饰紊乱与白血病，胶质瘤，乳腺癌，肝癌，宫颈癌和肺癌等多种肿瘤发生相关。如mettl3在肝癌中表达上调，促进肝癌进展；mettl3在肺腺癌中上调，促进肺癌细胞的生长、存活与侵袭；mettl14抑制肝癌细胞的转移；alkbh5在乳腺癌细胞通过促进nanogmrna稳定性起到维持细胞干性的作用；alkbh5通过靶向foxm1增强恶性胶质瘤细胞干性及成瘤能力。尽管m6a修饰参与了多种肿瘤的发生，但关于m6a修饰与尿路上皮癌的关系还未见报道。

ythdf2是第一个被鉴定的m6a识别蛋白，其c端的yth结构域特异性识别并结合含有m6a修饰的单链rna序列，并将发生该修饰的mrna定向运输至p小体内使其降解，从而调控靶基因的表达。目前已报道ythdf2参与了胰腺癌、胃癌、肝癌等多种恶性疾病的发生，而关于其是否参与尿路上皮癌发生发展还未见报道。探寻ythdf2在尿路上皮癌的作用具有重要意义，对尿路上皮癌的诊断、预防和治疗起着重要作用，并且为尿路上皮癌的基因靶向治疗提供可能。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供ythdf2基因在尿路上皮癌诊断、预防和治疗中的应用，旨在提供一种与尿路上皮癌发生发展相关的生物标志物，通过检测生物标志物的表达水平，可以实现尿路上皮癌的早期诊断，通过改变生物标志物的表达水平或活性，实现尿路上皮癌的精准分子靶向治疗。

本发明的技术方案如下：

检测ythdf2基因的试剂在制备诊断尿路上皮癌的产品中的应用。

本发明中，所述诊断尿路上皮癌的产品为制剂、芯片或试剂盒。优选的，所述芯片为基因芯片或蛋白芯片。优选的，所述试剂盒为基因检测试剂盒或蛋白检测试剂盒。

优选的，所述检测ythdf2基因的试剂为通过测序技术、核算杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测样本中ythdf2基因表达水平用的试剂。

本发明中，所述ythdf2基因在尿路上皮癌组织样品中表达上调。

优选的，采用rt-qpcr技术检测尿路上皮癌组织样本中ythdf2基因的表达水平。

优选的，所述诊断尿路上皮癌的产品中包括一对特异性扩增ythdf2基因的引物，所述引物序列如下：

ythdf2正向引物：5’-agccccacttcctaccagatg-3’；

ythdf2反向引物：5’-tgagaactgttatttccccatgc-3’。

ythdf2基因表达的抑制剂在制备治疗或预防尿路上皮癌的药物中的应用。

优选的，所述ythdf2基因表达的抑制剂为核酸抑制剂、蛋白抑制剂或蛋白结合分子。

有益效果：本发明首次确认了ythdf2在尿路上皮癌中的作用，ythdf2在尿路上皮癌组织中表达量上调，并且促进了尿路上皮癌细胞的增殖和迁移能力，ythdf2可作为临床尿路上皮癌诊断和治疗的潜在靶点。

附图说明

图1为利用rt-qpcr检测ythdf2mrna在尿路上皮癌组织中的表达情况图。

图2为ythdf2mrna在膀胱细胞系中的表达情况图。

图3为cck-8法检测ythdf2基因对尿路上皮癌细胞增殖的影响图。

图4为利用细胞划痕实验检测ythdf2对尿路上皮癌细胞迁移的影响图。

具体实施方式

本发明提供ythdf2基因在尿路上皮癌诊断、预防和治疗中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1、rt-qpcr检测ythdf2基因在尿路上皮癌组织的差异表达

收集39例尿路上皮癌组织及相对应的癌旁组织，组织样本的取得获得患者的知情同意，并且通过组织伦理委员会的同意。利用ambion的trizol试剂提取rna样品，具体步骤详见说明书。利用nanodrop2000对所提取的rna浓度和纯度进行检测。各取1μgrna用于反转录，采用vazyme的hiscriptqrtsupermix进行反转录获得cdna。根据ythdf2基因和rpl13a基因的序列设计引物，引物序列由上海生工合成。设计的引物序列如下：

ythdf2正向引物：5’-agccccacttcctaccagatg-3’

ythdf2反向引物：5’-tgagaactgttatttccccatgc-3’

rpl13a正向引物：5’-gccatcgtggctaaacaggta-3’

rpl13a反向引物：5’-gttggtgttcatccgcttgc-3’

配制10μl反应体系：2×sybrgreenmix5μl，正反向引物（10μm）各0.5μl，模板cdna(200ng)1μl，ddh2o3μl。各项操作均于冰山进行。每隔样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上保证结果的可重复性。扩增程序：95℃60s，（95℃15s，60℃15s，72℃30s）×45循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行qpcr反应，△△ct法进行基因的相对定量。所有实验均进行3次重复，数据以平均值±标准差的方式表示，用graphpadprism5进行统计作图。结果如图1所示，与癌旁组织相比，ythdf2基因在尿路上皮癌组织中表达上调。

实施例2、ythdf2基因在人尿路上皮癌细胞系的差异表达

人尿路上皮癌细胞株sw780和um-uc-3用dmem培养基培养，人尿路上皮癌细胞株t24和5637用1640培养基培养，永生化膀胱组织细胞系sv-huc-1培养在dmem/f-12中。培养条件为37℃，5%co2，90%湿度。2天换液，取生长旺盛的细胞，提取rna并进行反转录获得cdna，采用rt-qpcr检测ythdf2基因在尿路上皮癌细胞系的表达情况。结果如图2所示，与正常膀胱细胞系相比，ythdf2基因在尿路上皮癌细胞系sw780、umuc3、t24和5637中表达均上调。

实施例3、ythdf2基因敲除细胞系的构建

根据ythdf2基因序列设计sgrna，设计的sgrna引物序列如下：

sgrna1正向引物：5’-caccgtccattactagtaacatcg-3’

sgrna1反向引物：5’-aaaccgatgttactagtaatggac-3’

sgrna2正向引物：5’-caccgagttactacagtccctccat-3’

sgrna2反向引物：5’-aaacatggagggactgtagtaactc-3’

将上述引物溶解于ddh2o至终浓度为100μm，正反引物各取1μl加入到8μlddh2o中，按如下程序进行退火：37℃30min，95℃5min，按0.8℃/s的速度降温至25℃。取退火后的引物1μl，连接于lenticrisprv2载体。通过慢病毒将携带ythdf2sgrna的质粒转入sw780和t24细胞，加入嘌呤霉素，筛选获得ythdf2敲除的单克隆细胞系。

实施例4、cck8实验确定ythdf2对尿路上皮癌细胞系增殖作用的影响

将处于对数生长期的实验组细胞（ythdf2-ko）和对照组细胞t24或者sw780细胞(crisprv2-ev)按每一孔1000个细胞的密度接种在96孔板，待细胞贴壁后每隔24小时用cck8细胞增殖试剂盒检测细胞增殖情况。结果如图3所示，ythdf2敲除的细胞增殖速度明显低于对照组的细胞生长速度，且差异具有统计学意义，上述结果表明ythdf2的过表达能够促进尿路上皮癌细胞的生长。

实施例5、细胞划痕实验确定ythdf2对尿路上皮癌细胞迁移的影响

将对数生长的细胞按5×10⁵细胞/孔铺在6孔细胞培养板，待细胞贴壁长至90%密度后，用划痕器制造伤口，用pbs清洗去掉残留的细胞，更换无血清培养基培养，分别于24和48小时后用显微镜成像，观察比较实验组和对照组的伤口愈合情况。结果如图4所示，ythdf2敲除后sw780的迁移能力削弱，而ythdf2未敲除情况下能够增强sw780细胞的迁移能力。上述结果表明ythdf2促进尿路上皮癌细胞的迁移。

本发明中，所述ythdf2基因的氨基酸序列如下所示：

metseralaserserleuleugluglnargprolysglyglnglyasnlysvalglnasnglyservalhisglnlysaspglyleuasnaspaspaspphegluprotyrleuserproglnalaargproasnasnalatyrthralametseraspsertyrleuprosertyrtyrserproserileglyphesertyrserleuglyglualaalatryserthrglyglyaspthralametprotyrleuthrsertyrglyglnleuserasnglygluprohispheleuproaspalametpheglyglnproglyalaleuglyserthrpropheleuglyglnhisglypheasnphepheproserglyileasppheseralatryglyasnasnserserglnglyglnserthrglnserserglytyrserserasntyralatyralaproserserleuglyglyalametileaspglyglnseralaphealaasngluthrleuasnlysalaproglymetasnthrileaspglnglymetalaalaleulysleuglyserthrgluvalalaserasnvalprolysvalvalglyseralavalglyserglyserilethrserasnilevalalaserasnserleuproproalathrilealaproprolysproalasertryalaaspilealaserlysproalalysglnglnprolysleulysthrlysasnglyilealaglyserserleuproproproproilelyshisasnmetaspileglythrtryaspasnlysglyprovalalalysalaproserglnalaleuvalglnasnileglyglnprothrglnglyserproglnprovalglyglnglnalaasnasnserproprovalalaglnalaservalglyglnglnthrglnproleuproproproproproglnproalaglnleuservalglnglnglnalaalaglnprothrargtryvalalaproargasnargglyserglypheglyhisasnglyvalaspglyasnglyvalglyglnserglnalaglyserglyserthrprosergluprohisprovalleuglulysleuargserileasnasntyrasnprolysasppheasptryasnleulyshisglyargvalpheileilelyssertyrsergluaspaspilehisargserilelystyrasniletrycysserthrgluhisglyasnlysargleuaspalaalatryargsermetasnglylysglyprovaltyrleuleupheservalasnglyserglyhisphecysglyvalalaglumetlysseralavalasptyrasnthrcysalaglyvaltryserglnasplystrylysglyargpheaspvalargtryilephevallysaspvalproasnserglnleuarghisileargleugluasnasngluasnlysprovalthrasnserargaspthrglngluvalproleuglulysalalysglnvalleulysileilealasertyrlyshisthrthrserilepheaspasppheserhistyrglulysargglnglugluglugluservallyslysgluargglnglyargglylys

综上，本发明采用rt-qpcr技术对收集到的39对临床组织样本的m6a相关基因进行了检测，发现ythdf2在尿路上皮癌肿瘤组织中高表达，并且与病人的预后显著相关。采用rt-qpcr技术检测了ythdf2在膀胱组织相关细胞系的表达量，发现ythdf2在尿路上皮癌细胞系的表达量高于永生化膀胱组织细胞系sv-huc-1。为了研究ythdf2在尿路上皮癌发生发展的功能，采用crispr/cas9技术构建了ythdf2的敲除细胞系，利用cck-8实验和划痕实验检测了ythdf2敲除后对尿路上皮癌细胞增殖、迁移的影响，结果显示，ythdf2敲除后可显著降低尿路上皮癌细胞的增殖和迁移能力。因此ythdf2可称为尿路上皮癌治疗新的靶点，本发明确认了ythdf2在尿路上皮癌发生中的作用，提供ythdf2在制备尿路上皮癌诊断标志物，为靶向治疗尿路上皮癌的新药筛选提供了新的途径。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>深圳市罗湖区人民医院

<120>ythdf2基因在尿路上皮癌诊断、预防和治疗中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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