胎盘血CIK细胞改良的培养方法与流程

本发明涉及细胞培养
技术领域：
，具体而言，涉及一种胎盘血cik细胞改良的培养方法。
背景技术：
：胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘血的采集量一般在150ml以上，最多可以采集250ml，可采集量高于脐带血。胎盘血中富含原始造血干细胞，其数量和质量与骨髓媲美，数量高于脐带血中造血干细胞含量。白细胞含量11～19×109，远高于外周血，略高于脐带血。其中的单核细胞含量高于外周血和脐带血含量，单核细胞的含量将近脐血的2倍。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，cik)是一群在体外经il-1α、il-2、ifn-γ及抗cd3单克隆抗体等诱导而成的以cd3+cd56+细胞为主的cd4+和cd8+效应t细胞群，兼具有t细胞强大的杀瘤活性以及nk细胞的非主要组织相容性复合体(mhc)限制性杀瘤的优点。与其他过继免疫治疗细胞相比，cik具有增殖速度快、杀伤活性高、杀瘤谱广以及副作用小等特点，对正常骨髓造血功能影响甚微，被临床认为是一种有效的肿瘤免疫治疗手段。广泛应用于肾癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌和白血病等多种恶性肿瘤的治疗。cik可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。cik对肿瘤细胞有直接杀伤作用，通过分泌颗粒酶和穿孔素穿透靶细胞膜，直接导致肿瘤细胞破裂；cik具有较强的细胞毒活性，可分泌il-2、ifn-γ、tnf-α和gm-csf等多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。现有技术中的cik培育方法，普遍存在扩增倍率低、细胞活性差等问题。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种新颖的胎盘血细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，cik)的培养方法，该方法操作简单，培养得到cik质量较好，可用于cik的大量制备，使该方法更利于推广和应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明涉及一种胎盘血cik细胞改良的培养方法，包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有cd3抗体及cd28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为ifn-γ900u/ml～1100u/ml；2)向培养体系中加入il-2终浓度为900u/ml～1100u/ml，il-12终浓度为1.5ng/ml～2.5ng/ml，il-15终浓度为8ng/ml～12ng/ml，cd16抗体终浓度为1.5μg/ml～2.5μg/ml；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为il-2900u/ml～1100u/ml，il-154ng/ml～6ng/ml，il-121.5ng/ml～2.5ng/ml；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的gt-t581培养基；4)补加il-245～55万iu/400ml，培养2～4天后收获细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为：cik扩增效果好，且活化的cik占比更高、t-reg细胞占比更低。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为对本发明一个实施例培养得到的cik细胞表面标志物进行检测的结果。具体实施方式本发明涉及一种胎盘血cik细胞改良的培养方法，包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有cd3抗体及cd28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为ifn-γ900u/ml～1100u/ml；2)向培养体系中加入il-2终浓度为900u/ml～1100u/ml，il-12终浓度为1.5ng/ml～2.5ng/ml，il-15终浓度为8ng/ml～12ng/ml，cd16抗体终浓度为1.5μg/ml～2.5μg/ml；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为il-2900u/ml～1100u/ml，il-154ng/ml～6ng/ml，il-121.5ng/ml～2.5ng/ml；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的gt-t581培养基；4)补加il-245～55万iu/400ml，培养2～4天后收获细胞。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为ifn-γ950u/ml～1050u/ml。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为ifn-γ1000u/ml。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养体系中加入il-2的终浓度均为1000u/ml，il-12终浓度为2ng/ml，il-15终浓度为10ng/ml，cd16抗体终浓度为2μg/ml。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为il-2950u/ml～1050u/ml，il-154.5ng/ml～5.5ng/ml，il-121.7ng/ml～2.3ng/ml。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为il-21000u/ml，il-155ng/ml，il-122ng/ml；。在一些实施方式中，在步骤4)中，补加il-250万iu/400ml。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养容器包被有cd3抗体及cd28抗体的方法为：以所述培养面积为25cm2计，加入2.5～3.5ml含有cd3抗体400ng/ml～600ng/ml及cd28抗体400ng/ml～600ng/ml的包被液，在细胞培养条件下包被1.5h～2.5h。如非特别强调，本申请所述方法涉及到的细胞培养条件均在30至45℃之间和在1至10％的co2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的co2之间。加cd3，cd28的抗体是为了模拟t细胞的tcr激活和共刺激信号，是为了让t细胞活化进入到增殖的状态。在一些实施方式中，cd3抗体的浓度为500ng/ml。在一些实施方式中，cd28抗体的浓度为500ng/ml。在一些实施方式中，所述包被液的溶剂为d-pbs。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的vivo培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的vivo培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为8ml～12ml，细胞接种量为0.8×107～1.2×107。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为10ml，细胞接种量为1.0×107。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为20h～28h。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为24h。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为2d～4d。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为3d。在一些实施方式中，在步骤3)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的gt-t581培养基。在一些实施方式中，在步骤3)中，将细胞传代2～3次。在一些实施方式中，步骤3)的培养时间为8d～10d。在一些实施方式中，步骤3)的培养时间为9d。在一些实施方式中，步骤3)具体包括：a)以培养面积为75cm2计，加入15～25ml培养基培养3d；b)换液，以培养面积为175cm2计，加入60ml～80ml培养基培养3d；c)换液，使用培养袋进行培养，加入300ml～400ml培养基培养3d。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1本实施例涉及一种胎盘血cik改良的培养方法。1.胎盘血cik细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度400ng/ml，cd28抗体浓度600ng/ml。2)cik初始培养基：vivo培养基(含4％自体血浆)，ifn-γ900u/ml。3)cik培养基：gt-t581培养基(含4％自体血浆)，il-2浓度1100u/ml，il-154ng/ml，il-122.5ng/ml。2.胎盘血cik培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入2.5ml包被液，置于培养箱中包被2.5h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的胎盘血单核细胞0.8×107，接种到t25培养瓶内，加10mlcik初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-2，终浓度为900u/ml，il-12终浓度为1.5ng/ml，il-15终浓度为12ng/ml，cd16抗体终浓度为1.5μg/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加cik培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加cik培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlcik培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第13天，加il-2，45万iu。7)培养第16天，收获细胞。实施例2本实施例涉及一种胎盘血cik改良的培养方法。1.胎盘血cik细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度600ng/ml，cd28抗体浓度400ng/ml。2)cik初始培养基：vivo培养基(含6％自体血浆)，ifn-γ1100u/ml。3)cik培养基：gt-t581培养基(含6％自体血浆)，il-2浓度900u/ml，il-156ng/ml，il-121.5ng/ml。2.胎盘血cik培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入3.5ml包被液，置于培养箱中包被1.5h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的胎盘血单核细胞1.2×107，接种到t25培养瓶内，加10mlcik初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-2，终浓度为1100u/ml，il-12终浓度为2.5ng/ml，il-15终浓度为8ng/ml，cd16抗体终浓度为2.5μg/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加cik培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加cik培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlcik培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第13天，加il-2，55万iu。7)培养第16天，收获细胞。实施例3本实施例涉及一种胎盘血cik改良的培养方法。1.胎盘血cik细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度450ng/ml，cd28抗体浓度550ng/ml。2)cik初始培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ950u/ml。3)cik培养基：gt-t581培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1050u/ml，il-154.5ng/ml，il-122.2ng/ml。2.胎盘血cik培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入2.8ml包被液，置于培养箱中包被2.2h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的胎盘血单核细胞1.1×107，接种到t25培养瓶内，加10mlcik初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-2，终浓度为1050u/ml，il-12终浓度为1.8ng/ml，il-15终浓度为11ng/ml，cd16抗体终浓度为2.2μg/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加cik培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加cik培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlcik培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第13天，加il-2，48万iu。7)培养第16天，收获细胞。实施例4本实施例涉及一种胎盘血cik改良的培养方法。1.胎盘血cik细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度500ng/ml，cd28抗体浓度500ng/ml。2)cik初始培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ1000u/ml。3)cik培养基：gt-t581培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1000iuml，il-155ng/ml，il-122ng/ml。2.胎盘血cik培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入3ml包被液，置于培养箱中包被2h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的胎盘血单核细胞1.0×107，接种到t25培养瓶内，加10mlcik初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-2，终浓度为1000u/ml，il-12终浓度为2ng/ml，il-15终浓度为10ng/ml，cd16抗体终浓度为2μg/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加cik培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加cik培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlcik培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第13天，加il-2，50万iu。7)培养第16天，收获细胞，做流式检测；其结果如图1所示。对比例1胎盘血cik培养细胞方法1)培养第0天，取制备好的胎盘血单核细胞1.0×107，接种到t25培养瓶(未经过包被)内，加10mlcik初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入和il-2，终浓度为1000u/ml；加入cd3单抗浓度500ng/ml，cd28抗体浓度500ng/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。其余步骤同实施例4。对比例2cik细胞培养基替换为：1)cik初始培养基：rpm1-1640培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ1000u/ml。2)cik培养基：rpm1-1640培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1000iuml。其余培养条件同实施例4。对比例3一种胎盘血cik的培养方法。1.胎盘血cik细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度500ng/ml，cd28抗体浓度500ng/ml。2)cik初始培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ1000u/ml。3)cik培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1000iuml。2.胎盘血cik培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入3ml包被液，置于培养箱中包被2h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的胎盘血单核细胞1.0×107，接种到t25培养瓶内，加10mlcik初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-2，终浓度为1000u/ml，将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加cik培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加cik培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlcik培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第14天，收获细胞，做流式检测；实验例在收取实施例4及对比例1、2、3的细胞后，进行细胞计数，并通过流式细胞术对表型进行鉴定。每组重复六次，结果如下：组别细胞数实施例41.02×109对比例19.8×108对比例25.4×108*对比例36.2×108**p＜0.05，vs实施例4。*p＜0.05，vs实施例4。从上述结果可以看出，在本申请的培养体系下，rpm1-1640培养基并不能很好地促进细胞的增殖，但其对cik的分化无明显影响；而预先包被培养瓶，可以让后期接种的细胞完全接触到激活诱导因子，达到更好的激活诱导效果，因而能够得到更多的cd3+cd56+细胞；并通过控制分化时机，降低t-reg细胞的比例。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12