本发明属于rna干扰抗病毒领域，特别涉及一种wsv049的sirna在制备白斑综合症病毒制剂的应用。
背景技术：
日本囊对虾主要分布于印度、西太平洋地区，我国东南沿海也有少量分布。自上世纪70年代末，我国对虾养殖迅速发展成为海产养殖支柱产业，养殖量逐年攀升，带来了不可计数的经济效益并同时解决了成千上万人的就业问题。克氏原螯虾，也称为小龙虾，生命力顽强，对水文环境的整治有着极大的贡献，此外，克氏原螯虾肉质松软易消化，富含镁、锌、碘、硒等，能保护心血管系统，可减少血液中胆固醇含量，防止动脉硬化，有利于预防高血压及心肌梗塞。近年来，日本囊对虾和克氏原螯虾的养殖量逐年攀升，但各种问题也随之出现，其中最为严重，威胁最大的就是水产养殖过程中的病害问题，而各种病害中最为严重的是白斑综合症病毒(wssv)。wssv以其泛适性，高致病性，高死亡率而位居病害威胁之首。
白斑综合症杆状病毒复合体主要对虾的造血组织、结缔组织、前后肠的上皮、血细胞、鳃等系统进行感染破坏。急性感染会在短时间内引起虾摄食量大幅度下降，壳易剥离，并可见到明显白斑。从感染到死亡只有三到五天甚至更短，且传染性极强七天左右可以使虾池中70％的虾感染甚至死亡，给我国的水产养殖业带来难以估计的损失。虾类无脊椎动物的免疫特点使得水产养殖过程中抗病毒难度增大，防治手段匮乏。另外，各种消毒和防治药物的滥用也对环境和食品安全带来了极大的威胁。到目前为止，虽然在海洋无脊椎动物病害免疫防治方面有了长足的进步，但仍停留在非特异性增强机体抗病能力的方面，应对wssv这类急性高致死性病毒感染时难以达到预期效果。因而，寻找高效环保的wssv防治手段对病毒学研究及水产养殖业的可持续发展均具有重要的意义。
rna干扰(rnainterference,rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-strandedrna，dsrna)诱发的同源mrna高效特异性降解的现象。藉由这种高效的特异性降解作用。近年来，越来越多的研究证明rna干扰技术不仅可以应用于细胞和植物水平，在水生无脊椎动物中有着同样的作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种wsv049的sirna在制备白斑综合症病毒制剂的应用，通过利用wsv049-sirna干扰病毒复制相关基因wsv049的表达，达到抑制wssv增殖的目标，以解决wssv对海水和淡水养殖虾类感染并致死的现象等问题。
一种能抑制wssv的wsv049的sirna，序列为：
正义链：5'-cuggaagaaagucuucaaucagauu-3’
反义链：5'-ucugauugaagacuuucuuccaguu-3’。
上述能抑制wssv的wsv049的sirna的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)选取已验证的与wssv早期复制相关的编码基因；
(2)对干扰位点进行预测；
(3)按照sirna设计原则针对干扰位点设计最适wsv049-sirna；
(4)合成双链wsv049-sirna分子。
上述能抑制wssv的wsv049的sirna在制备白斑综合症病毒制剂的应用。
一种包含上述能抑制wssv的wsv049的sirna的制剂。
进一步的，包括饲料添加剂、固体或者液体药物。
进一步的，可用于淡水虾和海水虾。
进一步的，可用于日本囊对虾及克氏原螯虾。
本发明通过深入研究wssv感染过程中病毒基因的表达情况，发现wsv049作为病毒复制早期基因在其侵染过程中发挥着关键的作用。wsv049可能是wssv防治的新靶点。本发明wsv049-sirna能够高效抑制wssv的基因wsv049的表达，显著抑制wssv在虾体内的增值，大幅度降低wssv的累积致死率。同时适用于淡水养殖的克氏原螯虾和海水养殖的日本囊对虾。因此，wsv049-sirna有望成为抗wssv的新药物，广泛应用于水产养殖过程中wssv的防治工作。
本发明的wsv049的sirna能显著抑制病毒基因wsv049的表达：将wssv与wsv049-sirna共同注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内。与对照组相比，wsv049-sirna处理组的wsv049表达量显著降低。
本发明的wsv049的sirna能抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖：将wssv与wsv049-sirna共同注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内。与对照组相比，wsv049-sirna处理组虾体内病毒的复制显著受到抑制。
本发明的wsv049的sirna能降低wssv感染所导致的日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡：将wssv与wsv049-sirna共同注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内。与对照组相比，wsv049-sirna处理组的死亡率大幅降低。
本发明wsv049的sirna能够显著提高虾血淋巴细胞的活力，表明本发明能够增强虾对病毒的抵抗能力。
与现有技术相比，本发明的wsv049-sirna针对wssv复制早期基因wsv049进行特异性干扰，快速高效的抑制了wssv在虾体内的增殖，有效降低由wssv感染所导致虾死亡，能够显著提高病毒感染后虾血淋巴细胞的活力，能够增强日本囊对虾和克氏原螯虾对病毒的抵抗能力。不仅适用于海水养殖的日本囊对虾，同时适用于淡水养殖的克氏原螯虾，应用前景十分广阔，弥补了水产养殖过程中虾类防治wssv的不足，有望成为防治白斑综合症病毒的潜在药物。
附图说明
图1为wsv049-sirna对日本囊对虾及克氏原螯虾体内wsv049mrna的表达的影响；将wsv049-sirna与wssv混合后注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内，对照组注射wsv049-sirna-scrambled，检测注射48h后wsv049mrna的表达量。
图2为wsv049-sirna对日本囊对虾体内wssv复制的影响；将wsv049-sirna与wssv混合后注射至日本囊对虾体内，检测wssv感染0、6、24和48小时后wssv的拷贝数。
图3为wsv049-sirna对克氏原螯虾体内wssv复制的影响；将wsv049-sirna与wssv混合后注射至克氏原螯虾体内，检测wssv感染0、6、24和48小时后wssv的拷贝数。
图4为wsv049-sirna对wssv致死日本囊对虾的影响；将wsv049-sirna与wssv混合后注射至日本囊对虾体内，统计wssv感染6天内日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡率。
图5为wsv049-sirna对wssv致死克氏原螯虾的影响；将wsv049-sirna与wssv混合后注射至克氏原螯虾体内，统计wssv感染6天内日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡率。
图6为wsv049-sirna对日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力的影响；利用wssv感染日本囊对虾及克氏原螯虾后，向虾体内注射wsv049-sirna，对照组注射wsv049-sirna-scrambled，检测注射48h后虾体内的血淋巴细胞活力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
sirna的设计及制备方法
选取从实验室转录组数据中筛选并已进行过功能验证的与wssv早期复制相关的病毒编码基因，通过block-ittmrnaidesigner(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)在线软件预测该基因的干扰位点，并选择推荐分数高低顺序选择三个干扰位点，按照invitrotranscriptiont7kitforsirnasynthesis(takara,japan)试剂盒的说明对上一步中选取的干扰位点设计并合成sirna，在日本囊对虾及克氏原螯虾中进行干扰效果检测，选取干扰效果最好的sirna用于后续试验。其序列为：
正义链：5'-cuggaagaaagucuucaaucagauu-3’
反义链：5'-ucugauugaagacuuucuuccaguu-3’。
实施例2：
wsv049-sirna抑制病毒基因wsv049在日本囊对虾及克氏原螯虾体内表达的试验
将体重10-12g的健康日本囊对虾和克氏原螯虾分别用海水和淡水在室内养殖池暂养一周后分为3组，阳性对照组(wssv)，实验组(wssv+wsv049-sirna),阴性对照组(wssv+wsv049-sirna-scrambled)，每组20只。用医用注射器于虾第四腹节的一侧肌肉注射100微升105拷贝数/毫升的wssv病毒溶液，实验组同时注射30μg/只的wsv049-sirna，阴性对照组同时注射30μg/只的wsv049-sirna-scrambled。水温控制在25-26℃，每天换水1/2，并持续充氧。
注射48h后，每个组随机抽取5只虾，收集虾血淋巴细胞。用总rna提取试剂盒(tiangen)抽取总rna，然后使用takara的反转录试剂盒将rna反转成双链cdna，最后利用takara的premixextaqtm进行wsv049mrna表达量的检测。用来扩增wsv049mrna的荧光定量pcr引物分别为为p1,p2。
p1:5’-gaagaatgcgttgttcaagcatgac-3’；p2:5’-tgttagagatattgttggatttaaa-3’。
结果见图1，wsv049-sirna注射后48h，日本囊对虾及克氏原螯虾体内wsv049mrna的表达量显著低于注射wsv049-sirna-scrambled的阴性对照组，表明wsv049-sirna可以显著抑制病毒基因wsv049在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的表达。
实施例3：
wsv049-sirna抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内增殖的试验
将体重10-12g的健康日本囊对虾和克氏原螯虾分别用海水和淡水在室内养殖池暂养一周后分为三组，阳性对照组(wssv)，实验组(wssv+wsv049-sirna),阴性对照组(wssv+wsv049-sirna-scrambled)，每组20只。用医用注射器于虾第四腹节的一侧肌肉注射100微升105拷贝数/毫升的wssv病毒溶液，实验组同时注射30μg/只的wsv049-sirna，阴性对照组同时注射30μg/只的wsv049-sirna-scrambled。水温控制在25-26℃，每天换水1/2，并持续充氧。
分别在注射0、6、24和48小时后，每个组随机抽取5只虾，将虾背部肌肉剪取适量，用组织基因组dna提取试剂盒(tiangen)抽提总dna，然后使用takara的premixextaqtm(probeqpcr)试剂盒进行病毒拷贝数的检测。用来扩增特异性wssv基因片段的荧光定量pcr的引物分别为p1,p2。
p1:5’-atgtctgcatctttaat-3’；p2:5’-ttatgacacaaacctat-3’。
结果见图2和图3，wsv049-sirna注射后24和48小时，日本囊对虾及克氏原螯虾体内wssv的拷贝数显著低于阳性对照组及注射wsv049-sirna-scrambled的阴性对照组，表明wsv049-sirna可以显著抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖。
实施例4：
wsv049-sirna降低wssv感染后日本囊对虾及克氏原螯虾死亡率的试验
将体重10-12g的健康日本囊对虾和克氏原螯虾分别用海水和淡水在室内养殖池暂养一周后分为6组，每组20只。第一组只注射wssv，第2组注射wssv和wsv049-sirna，第3组注射wssv和wsv049-sirna-scrambled，第4组只注射pbs，第5组不处理，第6组只注射wsv049-sirna，注射方法见实施例1。每天观察3次持续观察5天，及时清理死虾并记录死亡数。
结果见图4和图5，不同处理组日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡率随时间而升高，未注射病毒组(pbs注射组、wsv049-sirna注射组及未处理组)的死亡率相近，而wssv+wsv049-sirna注射组的死亡率显著性地低于wssv注射组和wssv+wsv049-sirna-scrambled注射组。表明wssv感染日本囊对虾及克氏原螯虾后，注射wsv049-sirna可大幅降低由wssv感染所导致的虾死亡。
实施例5：
wsv049-sirna增强wssv感染后日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力的试验
将体重10-12g的健康日本囊对虾和克氏原螯虾分别用海水和淡水在室内养殖池暂养一周后分为4组，每组20只。第一组只注射wssv，第2组注射wssv和wsv049-sirna，第3组注射wssv和wsv049-sirna-scrambled，第4组不处理，注射方法见实施例1。注射48h后，每个组随机抽取5只虾，收集虾血淋巴细胞，并利用abnova公司的cellviabilityassaykit(greenfluorescence)试剂盒检测血淋巴细胞的活力。
结果见图6，wssv感染后，日本囊对虾和克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力急剧降低。相较于对照组wssv和wssv+wsv049-sirna-scrambled，同时注射wssv和wsv049-sirna的实验组虾体内血淋巴细胞活力显著升高，表明注射本发明sirna能够显著提高病毒感染后虾血淋巴细胞的活力，能够增强日本囊对虾和克氏原螯虾对病毒的抵抗能力。
sequencelisting
<110>汕头大学
<120>一种wsv049的sirna在制备白斑综合症病毒制剂的应用
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