一种提高棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化效率的方法与流程

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种提高棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化效率的方法。

背景技术：

种子细胞是心肌组织工程策略和细胞治疗策略的基础。目前用于受损心肌修复的种子细胞包括终末分化的心肌细胞，各种不同来源和不同发育阶段的组织干细胞(如脂肪间充质干细胞(adscs)，骨髓间充质干细胞等)，以及全能干细胞(如胚胎干细胞(escs)和诱导多能干细胞(ipsc))等。这些细胞均能在一定程度上改善心脏功能，但是也存在诸如来源有限、扩增效率低、心肌分化能力有限、一定致瘤性等缺点。同时由于心梗区的恶劣微环境特征，也使移植的细胞存活能力较低，从而致使其对受损心肌的修复效果受到了一定的限制。针对这些问题，近年来国内外学者进行了深入研究，获得了一些有意义的研究结果。目前的研究主要以改善干细胞运输、存活、增殖、分化、发挥功能为目的，通过药物、因子或微环境预处理以提高干细胞向功能性细胞分化的能力。组织来源的干细胞是心脏再生及心肌组织工程研究中另一类重要的种子细胞来源，主要包括骨髓来源间充质干细胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,bmscs)、脂肪来源间充质干细胞(adiposederivedstemcells,adscs)等。已有研究表明，间充质干细胞能够有效分化为心肌细胞，并已有心梗治疗的临床试验研究，证明其对梗死心脏的收缩及舒张功能的有效改善作用。其中，脂肪作为人体易获得的组织，含有大量的间充质干细胞，2004年，planat-benard等首次证明了小鼠脂肪来源的干细胞有0.02％到0.07％能够自发分化为心肌细胞。2006年，yamada等发展了一种分离badscs的方法，并证明了badscs具有高效心肌分化能力，分化能力能够达到20％，体内心梗研究显示能够有效分化形成心肌细胞，促进心梗大鼠的心脏功能。liu等在badscs分离技术上进行改进，提高了badscs的纯度及数量，满足了心肌组织构建所需种子细胞的数量。我们研究组利用badscs与壳聚糖水凝胶、pnipaam/swcnts等支架进行了心肌再生研究，证明了badscs在体内向心肌分化，并对心梗心脏的功能具有明显的促进作用。棕色脂肪组织来源的心脏干细胞(adsc)具有来源丰富，收集细胞量大，患者易于接受等优势。但目前的分离培养方法针对棕色脂肪干细胞向心肌分化的效率较低，迫切需要找到提高其向心肌细胞分化的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种提高棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化效率的方法。

为实现上述技术目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种提高棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化效率的方法，是利用心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质培养棕色脂肪干细胞，分化为心肌细胞。

上述提高棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化效率的方法，按照如下步骤进行操作：

s1.取1天龄sd大鼠心脏置于预冷的pbs液体中，剪碎，利用0.05％胰酶完全消化组织块，1000rpm/7分钟离心，获得细胞沉淀，于高糖dmem加15％胎牛血清中重悬并接种在培养皿中，1小时后弃去未贴壁的心肌细胞，获得原代心肌成纤维细胞。

s2.利用高糖-dmem加10％胎牛血清培养心肌成纤维细胞至85-90％融合后消化，并接种于24培养孔板中，培养10天，弃去培养基，pbs冲洗3遍，加入体积分数为0.3％的tritonx-100和20mm的nh4ohpbs，37℃条件下处理5分钟，弃去消化液，pbs洗两次，得到心肌成纤维细胞分泌的细胞外基质。

s3.取3周龄sd大鼠，断颈处死，于75％乙醇浸泡后取出背部和肩胛骨周围的棕色脂肪组织，用预冷的pbs洗三次，剪碎，加入10ml混合消化酶，37℃旋转搅拌消化40min，充分吹吸后筛网过滤，弃去残余组织块，收集消化液，600g离心8min，用无血清的α-mem培养基洗涤沉淀1次，将细胞接种于心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质上进行培养，最终得到分化的心肌细胞。

所述步骤s3中混合消化酶的成分为α-mem培养基、0.25％胰酶、ⅳ型胶原酶、dispase酶，四者的重量比为4:4:1:1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：棕色脂肪组织来源的心脏干细胞来源丰富，收集细胞量大，患者易于接受，本发明利用心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质提高棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化的方法，提高了棕色脂肪干细胞向心肌分化的效率。

附图说明

图1中a-a1为导致相差显微镜观察衍生基质形态图；a-a2为天狼猩红检测胶原分布图；b为sem检测衍生基质图；c为总蛋白测定结果图；d为免疫荧光染色检测基质组分图。

图2中为a为cck-8测定细胞增殖情况图；b为免疫荧光染色检测ph3表达图。

图3为免疫荧光染色检测gata4表达情况图。

图4为免疫荧光染色检测心肌细胞标记物的表达图。

图5为流式细胞术检测badsc向心肌细胞的分化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化

1.取新生1天龄sd大鼠，开胸，取心脏，于预冷的pbs液体中，剪碎，并利用0.05％胰酶反复消化直至组织块消化完全，1000rpm/7分钟离心，获得细胞沉淀，于高糖dmem加15％胎牛血清(gibco)中重悬并接种在培养皿上，1小时后弃去未贴壁的心肌细胞，获得原代心肌成纤维细胞。

2.利用高糖-dmem加10％胎牛血清培养心肌成纤维细胞至85-90％融合后消化，并接种于24培养孔板中，培养10天。弃去培养基，并利用pbs冲洗3遍，加入0.3％(体积/体积)tritonx-100和20mm的nh4ohpbs在37℃条件下处理5分钟，弃去消化液，pbs洗两次，得到心肌成纤维细胞分泌的细胞外基质。如图1a-a1所示，光镜下观察，可看到孔板表面被心肌成纤维细胞分泌的细胞外基质覆盖，形成一个互相连接的多孔基质网络。

对其进行天狼猩红染色，检测基质中胶原的含量及分布，如图1a-a2所示，心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质中含有大量的胶原且分布均匀。扫描电镜(sem)检测表明，ecm超微结构由片状和颗粒状材料结构组成。为了进一步检测脱细胞后细胞衍生的细胞外基质的保留(图1b)，对脱细胞前后的蛋白总量进行测定，结果显示脱细胞后蛋白总量与脱细胞前降低17％左右，但无统计学差异，说明在脱细胞过程中即便会损失部分蛋白，但依然可以保留大部分细胞衍生的蛋白组成(图1c)。同时利用免疫荧光检测基质组成成份，结果显示心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质组份中含有胶原(ⅰ、ⅲ、ⅳ型)，纤黏连蛋白(fibronection)，层黏连蛋白(laminin)，微管蛋白(图1d)。

3.配制棕色脂肪干细胞(badscs)混合消化酶液，37℃预热备用，混合消化酶液中α-mem培养基(gibco)：0.25％胰酶(sigma)：ⅳ型胶原酶(sigma)：dispase酶(sigma)＝4:4:1:1。取3周龄sd大鼠，断颈处死，75％乙醇浸泡消毒后转移到超净工作台中，剪开大鼠背部皮肤，用剪刀小心取出背部和肩胛骨周围的棕色脂肪组织，用预冷的pbs洗三次。收集的组织尽量剪碎，然后加入10ml混合消化酶，37℃旋转搅拌消化40min，直到无肉眼可见大块脂肪组织，含血清的培养基中止消化，充分吹吸后筛网过滤，弃去残余组织块，收集消化液，600g离心8min，用无血清的α-mem培养基洗涤沉淀1次，以合适的密度将细胞接种于培养板，以及接种于心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质上进行培养。

实施例2转化率检测

1.利用cck-8检测培养1/2/3/4/5/7天badsc的增殖情况，将培养的细胞用pbs冲洗3遍，加入含10％的cck-8溶液，并在37℃孵育1.5小时，吸取上清，利用酶标仪在450nm条件下检测od值，如图2a所示，接种于衍生基质材料上的badsc具有更强的增殖能力。利用免疫荧光检测细胞周期相关检测点ph3的表达，如图2b所示，结果同样证实细胞外衍生基质促进badsc的细胞周期激活，进入s期的细胞显著增加。

2.进一步检测badsc在基质材料上向心肌谱系的分化情况。收取培养3天和7天的badsc细胞，pbs洗三次，4％多聚甲醛固定30分钟后，进行免疫荧光染色，添加与心肌分化增殖和存活相关的心肌早期标记物gata4抗体，并利用激光共聚焦进行图像采集。如图3所示，与单纯培养badsc相比，心肌成纤维细胞衍生基质上的badsc细胞表达对照组表达gata4较多，且随着培养时间的延长，实验组及对照组的gata4的表达均显著下调，单纯badsc培养组基本无gata4的表达，而衍生基质材料上的细胞依然可以检测到部分心肌早期标记物的表达，这证明衍生基质可促进badsc持续表达gata4，促进basc向心肌细胞的分化与存活。

3.badsc培第养14天，收集样品检测badsc向心肌细胞的分化。如图4所示，通过比较心肌细胞标记物α-actinin、c-tnt、tnnt2的表达发现，衍生基质材料上培养的badsc向心肌细胞分化更多。

4.利用流式细胞术检测培养14天badsc向心肌细胞分化的比例。将利用4％多聚甲醛固定的badsc细胞进行流式抗体标记，抗体稀释浓度为1:200，利用流式细胞仪检测c-tnt的阳性比例。如图5所示，无衍生基质组中badsc表达c-tnt的比例为15.33％，而衍生基质组中badsc表达c-tnt的比例为42.57％。进一步证实心肌成纤维细胞衍生的细胞外基质可促进badsc向心肌细胞的分化。

以上公开的仅为本发明的一个具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。