一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌。

背景技术：

凝结芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，营养细胞呈杆状，两端钝圆，单个、成对、少数呈短链状，芽孢端生，无鞭毛，最适生长温度为45℃～50℃，最适ph为6.6～7.0，其能分解小分子糖类生成l-1乳酸，为同型乳酸发酵菌，过氧化氢酶阳性。凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐胃酸、耐热、耐胆碱盐、降解亚硝酸盐、容易培养和保存等特点。凝结芽孢杆菌具有调节消化道微生态平衡，促进机体对营养物质的消化吸收，具有促进产生多种消化酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶及乳酸脱氢酶等有助于提高胃肠道对食物消化；在肠道内生长、繁殖和定植后，其自身能直接产生多种营养物质供机体吸收利用；可以通过产生乳酸促进动物机体对铁、磷、钙和维生素d等的吸收。还可以提高免疫力，增强抗病力，能够提高免疫系统的免疫能力，增强吞噬细胞的活性，增加胃肠道等器官对病原微生物的抵抗能力。

而硒作为一种与人体健康密切相关的微量元素，在人体内的含量与其生理学作用有着密切的关联，缺硒或者硒过量都会对人体造成危害。在自然界中，硒多数以硒酸盐或亚硒酸盐形式存在，微生物在硒的地球化学循环中发挥着重要作用，微生物可以通过异化还原作用，将有毒性的氧化态亚硒酸盐、硒酸盐还原为低毒性的单质硒，或者通过同化反应合成硒蛋白、含硒蛋白。

目前微生物富集硒主要是富硒酵母和富硒真菌。但未见高富硒凝结芽孢杆菌相关报道。

技术实现要素：

为了解决上述技术缺陷，本发明提供一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，通过微生物转化法将无机硒转化为可食用的有机硒，用于人体补充硒元素。

一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，包括如下步骤：

s1、凝结芽孢杆菌分离、纯化，以获得菌种、备用；

s2、将步骤s1获得的菌种接种于不含硒的lb液体培养基中，并培养6h后向lb液体培养基中加入硒源，恒温震荡培养后，离心去除上清培养基，收集菌体沉淀，即获得富硒凝结芽孢杆菌。

优选地，步骤s1中每1g含有凝结芽孢杆菌的样品溶于100ml无菌水中，并在70℃水浴20min、冷却后取0.1ml涂布于lb固体培养基平板上培养；当平板上长出单个菌落后，将单个菌落挑取出来接种到lb液体培养基中，在37-50℃、100-250rpm条件下培养，当培养基变浑浊后，进行平板划线法再次纯化，每天观察平板上菌落生长情况，重复分离纯化直至菌落形态一致，作为菌种备用。

进一步地，于37-50℃下在lb固体培养基平板上培养；

步骤s2中，硒源为含亚硒酸根、硒酸根的溶液，且加入硒源后使得培养基中硒含量为0.1～500μg/ml；优选硒源为亚硒酸钠溶液。

优选地，步骤s2中，按照2-6％接种量接种于不含硒的lb液体培养基中；

进一步地，步骤s2中，在37-50℃、100-250rpm条件下培养6h；

进一步地，步骤s2中，在37-50℃、100-250rpm条件下恒温震荡培养24～48h。

本发明一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其优点是：选用凝结芽孢杆菌作为原料进行富硒，可以高效的将无机硒转化为有机硒、微生物纳米硒，为无机硒转化为有机硒提供了一种高效、安全的途径，在安全补硒领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例一的步骤s1中，凝结芽孢杆菌分离、纯化后的形态特征图；

图2硒转化后上清培养基中硒形态检测图；

图3为凝结芽孢杆菌硒转化后形态测定，为未酶解检测；

图4为凝结芽孢杆菌硒转化后形态测定，为酶解后检测；

图5为不同浓度和时间对凝结芽孢杆菌硒转化效率的影响图。

具体实施方式

以下就具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例一

s1、凝结芽孢杆菌分离、纯化

取1g含有凝结芽孢杆菌的样品溶于100ml无菌水中，在70℃水浴20min，水浴结束后马上冷却，取0.1ml涂布于lb固体培养基平板上，放在45℃下培养，当平板上长出单个菌落后，将单个菌落挑取出来接种到lb液体培养基中，在45℃、200rpm条件下培养，当培养基变浑浊后，进行平板划线法再次纯化，每天观察平板上菌落生长情况，重复分离纯化直至菌落形态一致，作为菌种备用；

形态特征观察：该富硒凝结芽孢杆菌在45℃的lb固体培养基中培养30小时观察到凝结芽孢杆菌菌落形态为不透明的乳白色，呈圆形、表明突出(如图1所示)。

s2、菌种活化后，按照2％接种量接种于不含硒的lb液体培养基中，45℃、250rpm培养6h后向培养基中加入亚硒酸钠溶液，使培养基中硒含量为50μg/ml，加入亚硒酸钠后继续恒温震荡培养32h后，离心去除上清培养基，收集菌体沉淀，即获得富硒凝结芽孢杆菌。

实施例二

s1、凝结芽孢杆菌分离、纯化

取2g含有凝结芽孢杆菌的样品溶于200ml无菌水中，在70℃水浴20min，水浴结束后马上冷却，取0.1ml涂布于lb固体培养基平板上，放在50℃下培养，当平板上长出单个菌落后，将单个菌落挑取出来接种到lb液体培养基中，在50℃、250rpm条件下培养，当培养基变浑浊后，进行平板划线法再次纯化，每天观察平板上菌落生长情况，重复分离纯化直至菌落形态一致，作为菌种备用；

形态特征观察：该富硒凝结芽孢杆菌在45℃的lb固体培养基中培养30小时观察到凝结芽孢杆菌菌落形态为不透明的乳白色，呈圆形、表明突出。

s2、菌种活化后，按照4％接种量接种于不含硒的lb液体培养基中，50℃、250rpm培养6h后向培养基中加入亚硒酸钠溶液，使培养基中硒含量为200μg/ml，加入亚硒酸钠后继续恒温震荡培48h后，离心去除上清培养基，收集菌体沉淀，即获得富硒凝结芽孢杆菌。

实施例三

s1、凝结芽孢杆菌分离、纯化

取1g含有凝结芽孢杆菌的样品溶于100ml无菌水中，在70℃水浴20min，水浴结束后马上冷却，取0.1ml涂布于lb固体培养基平板上，放在37℃下培养，当平板上长出单个菌落后，将单个菌落挑取出来接种到lb液体培养基中，在37℃、100rpm条件下培养，当培养基变浑浊后，进行平板划线法再次纯化，每天观察平板上菌落生长情况，重复分离纯化直至菌落形态一致，作为菌种备用；

形态特征观察：该富硒凝结芽孢杆菌在45℃的lb固体培养基中培养30小时观察到凝结芽孢杆菌菌落形态为不透明的乳白色，呈圆形、表明突出。

s2、菌种活化后，按照6％接种量接种于不含硒的lb液体培养基中，37℃、100rpm培养6h后向培养基中加入亚硒酸钠溶液，使培养基中硒含量为500μg/ml，加入亚硒酸钠后继续恒温震荡培养24h后，离心去除上清培养基，收集菌体沉淀，即获得富硒凝结芽孢杆菌。

一、测定上述实施例一至实施例三获得的富硒凝结芽孢杆菌中无机硒含量，无机硒转化效率根据公式：无机硒转化率＝100％－(培养基中无机硒量/加入总硒量)×100％。测定结果如下表1所示：

表1

由上表1可知，凝结芽孢杆菌能够转化亚硒酸钠，且在24h时加入200μg/ml硒转化率为100％；其硒转化后上清培养基中硒形态检测图如图2所示。

二、对凝结芽孢杆菌硒转化后的形态测定

将上述实施例一至实施例三获得的富硒凝结芽孢杆菌均通过超声波细胞破碎仪使菌体破碎，破碎后分为两部分，一部分3000rpm离心去沉淀留上清，将上清过0.22μm滤膜，进行高效液相-原子荧光联用检测(如图3所示)。

另一部分加入蛋白酶k和胰蛋白酶在55℃条件下将菌体中蛋白质酶解，酶解完成后，3000rpm离心去沉淀留上清，上清过0.22μm滤膜，进行高效液相-原子荧光联用检测(如图4所示)。

结果如下表2所示：

表2

由上表2可知：凝结芽孢杆菌能够将亚硒酸钠转化，菌体在未酶解的情况下未能检测出有机硒形态，在酶解后能够检测出有机硒形态，并且生成硒代胱氨酸，通过加标回收进一步确定，其菌体干粉中硒含量为0.1～3000μg/g。

三、不同浓度和时间对凝结芽孢杆菌硒转化效率的影响

菌种活化后，按照1％接种量接种于不含硒的lb液体培养基中(分为四个组)，45℃、200rpm培养过夜后向培养基中加入亚硒酸钠溶液，使四组培养基中硒含量分别为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，加入亚硒酸钠后每组继续恒温震荡培养2h、4h、6h、8h后分别取样，测定培养基中无机硒含量，无机硒转化效率根据公式：无机硒转化率＝100％－(培养基中无机硒量/加入总硒量)×100％。

结果如图5所示：

从图1中可知：当菌液中加入亚硒酸钠溶液后，当硒浓度为25μg/ml时，加入2h后溶液中无机硒全部被转化；

当硒浓度为50μg/ml时，加入6h后溶液中无机硒全部被转化；

当硒浓度为100μg/ml时，加入8h后溶液中无机硒全部被转化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。