本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的snp标志物及其应用。
背景技术：
紫杉烷，包括紫杉醇和多西紫杉醇，被广泛用于多种实体瘤的标准治疗中，例如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞型肺癌和头颈癌。紫杉醇能够促进细胞微管形成并能阻止其生理解聚，抑制癌细胞的快速分裂从而抑制肿瘤生长。然而，紫杉烷在癌症治疗过程中常引起药物不良反应，例如骨髓抑制、周围神经病变和胃肠道毒性。特别得，骨髓抑制在大约80％的接受紫杉烷治疗的患者中出现，是紫杉烷治疗终止的主要原因之一。
骨髓抑制是指血细胞减少，包括中性粒细胞减少症，白细胞减少症，贫血或血小板减少症。其中，中性粒细胞减少症在紫杉烷治疗中最为常见。由于血液中的红细胞和白细胞都源于骨髓干细胞，血液中的血细胞寿命短，常常需要不断补充，为了达到及时补充的目的，作为血细胞前体的干细胞必须快速分裂，但紫杉烷类化疗药物常常导致正常骨髓细胞受到抑制。骨髓抑制增加感染败血症的风险，严重的骨髓抑制会危及患者的生命。
现有的紫杉烷治疗是基于体表面积的，不能在不同患者中预防剂量相关的骨髓抑制。也就是说，对接受紫杉烷类药物化疗的患者不能进行骨髓抑制发病风险的诊断。虽然提前使用集落刺激因子(colony-stimulatingfactors，csfs)可以减少中性粒细胞减少症的发生风险，但高昂的费用使得并非每位患者都将csfs作为常规使用。现有基于紫杉烷的化疗没有考虑个体在药物代谢动力学和药物反应上的差异，从而导致药物不良反应的高发生率，这些个体差异是由多种因素造成，包括年龄、性别、种族、生活习惯，肝功能和基因多态性。其中，基因因素可以是10-20％药物不良反应发生的原因。研究表明，基于患者基因组成的个体化用药已经显示能减少药物不良反应的发生。因此，明确基因和紫杉烷的关联并发现骨髓抑制的基因标记是十分重要的。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是指人群中出现频率大于1％的单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，它是人类最常见的可遗传变异。snp的存在能影响基因的结构或功能，赋予个体对环境暴露、药物治疗等的不同反应，从而产生不同的表型，因此snp可能是导致个体疾病发生发展差异的重要遗传基础。一些基因多态性位点在不同种族中的分布不同，而之前的大部分研究是在高加索人群中完成的，因为两个种族的基因频率并不完全相同，其研究结果可能不适用于汉族患者，不能精确的用于中国汉族人群的临床用药指导，并且之前的骨髓抑制研究结果需要在中国汉族人群中做进一步验证。有研究表明，这种基于种族的遗传差异可能是中国人群骨髓抑制的发生率更高的原因之一。考虑到中国汉族人群占亚洲人中的大多数，因此在中国汉族人群中的研究尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的snp标志物及其应用，具体地，本发明的第一个目的在于提供一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的snp标志物，通过对癌症患者外周血基因组dna的分子标记进行检测，寻找一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的易感snp，为今后临床上早期预防紫杉烷相关骨髓抑制提供潜在的生物标志物，为紫杉烷类化疗药物骨髓抑制毒性的预防和控制提供数据支持。本发明的第二个目的在于提供上述snp标志物的特异性扩增引物。本发明的第三个目的在于提供上述snp标志物的特异性延伸引物。本发明的第四个目的在于提供上述snp标志物及其特异性扩增引物、特异性延伸引物在制备紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒中的应用。本发明的第五个目的在于提供上述snp标志物及其特异性延伸引物在制备紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒中的应用。本发明的第六个目的在于提供紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒，以用于临床上早期预防紫杉烷相关骨髓抑制，促进紫杉烷的精准用药的实现。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的：
一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的snp标志物，包括slc15a1基因上的rs2297322、hnf4α基因上的rs6130615中的至少一种。
用于检测所述的snp标志物的特异性扩增引物，包括rs2297322的扩增引物、rs6130615的扩增引物中的至少一种；其中，rs2297322的扩增引物序列为seqidno:1和seqidno:2，rs6130615的扩增引物序列为seqidno:4和seqidno:5。
用于检测所述的snp标志物的特异性延伸引物，包括rs2297322的延伸引物、rs6130615的延伸引物中的至少一种；其中，rs2297322的延伸引物序列为seqidno:3，rs6130615的延伸引物序列为seqidno:6。
所述的snp标志物的特异性扩增引物在制备紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒中的应用。
所述的snp标志物的特异性延伸引物在制备紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒中的应用。
一种紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒，所述试剂盒含有所述的rs2297322的扩增引物和rs6130615的扩增引物、所述的rs2297322的延伸引物和rs6130615的延伸引物。
优选地，所述试剂盒的检测样本为外周血，用于检测外周血dna中的rs2297322和rs6130615。
优选地，所述试剂盒还包括pcr技术常用的试剂，如taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、去离子水等，还可以含有标准品和/或对照品。
上述snp位点：rs2297322和rs6130615的引物信息如下表所示：
表1.相关snp位点的引物信息
表1中alleles：等位基因；maf：最小等位基因频率；2nd-pcrp：pcr扩增的后引物；1st-pcrp：pcr扩增的前引物；uep_seq：单碱基延伸引物。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；(2)基因型检测：选择基于紫杉烷药物化疗的肿瘤患者，查阅已有文献，找出直接参与紫杉烷代谢通路的基因和与药物代谢相关的其他基因。对筛选出来的snp，进一步采用基因分型进行检测，找出与紫杉烷化疗药物骨髓抑制相关的snp，并验证将其应用于诊断的可重复性。(3)紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒的研制：根据不同程度骨髓抑制的癌症患者中基因型分布频率有显著性差异的snp位点开发snp诊断试剂盒。
具体来说本研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
所有研究对象至少接受基于紫杉醇或多西紫杉醇的化疗一周期。所有患者均为无血缘关系的中国汉族人群。除有骨转移的患者，所有患者基线嗜中性细胞绝对计数需大于1.5×109/l。有严重肝损伤，急性感染或伴随其他可能影响其药物反应的疾病的患者不予入组。能获得完整的随访信息，并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
对上述纳入病患，依据知情同意原则患者签署知情同意书。使用commonterminologycriteriaforadverseeventversion3.0(ctcae3.0)评估骨髓抑制。中性粒细胞减少症，白细胞减少症，贫血或血小板减少症任何一项及更多发生即被定义为骨髓抑制。在治疗过程中，每个患者发生的最高的骨髓抑制分级被记录用于数据分析。根据收集得到的骨髓抑制分级将患者分为严重药物不良反应组(adrgruop)与对照组(controlgroup)。严重药物不良反应组的患者在紫杉烷治疗后患iii或iv级骨髓抑制，而对照组中的患者患0-ii级骨髓抑制。
2.基因组dna样品准备
所有血样在dna抽提前放于-80℃保存。基因组dna使用qiaampdnaminikit(qiagengmbh，hilden，germany)从外周血中抽提，并储存于-20℃。基因组dna样品抽提之后应用紫外分光光度计进行浓度测定，通常能得到纯度(紫外2600d与2800d比值)在1.6～2.0的dna。然后用去离子水稀释为浓度10～20ng/μl。由于样品量大，必须做好样品标记，分装在96孔板中保存，方便后序384管进行分装。
3.snp分型
对包含slc15a1基因上rs2297322、hnf4α基因上rs6130615多态位点的dna片段进行特异性扩增，并对所获得的dna片段进行测序，得到rs2297322和rs6130615位点的基因型数据。
4.统计分析
对比上述两组患者的基线信息，运用卡方检测和t检测。对所有snp进行哈迪-温伯格平衡(hwe)检测，检查snp的基因型分布。maf<0.01,hwe<0.01的snp以及基因分型成功率<0.95的样本被剔除。利用加性模型，显性模型和隐性模型分别进行多元逻辑回归来评估每个snp的分型对药物不良反应发生的贡献。p值<0.05的snp位点被认为与骨髓抑制显著相关。为了降低假阳性率，我们将结果缩小为p<0.01或在随后的验证分析中被验证。以上所有的数据分析使用专门的统计学分析软件plink1.07和spss17.0完成。
5.结果分析
药物转运基因slc15a1基因rs2297322(350g>a)突变与紫杉烷相关骨髓抑制有关。验证分析中证实其增加发生白细胞减少症和中性粒细胞减少症的风险。本发明的研究中rs2297322与骨髓抑制的相关性较强(rec，p<0.01，or＝3.571，95％ci：1.358-9.394)。同时，位于核受体基因hnf4α的rs6130615(1132c>t)在骨髓抑制(rec,or＝2.807,95％ci＝1.077-7.316,p＝0.035)和白细胞减少症(rec，or＝2.933，95％ci：1.017-8.464，p＝0.047)两次分析中均显示出显著相关性。
6.诊断试剂盒制备方法
sequenommassarraysystem基因分型平台进行验证后确定了不同程度骨髓抑制毒性的癌症患者中基因型分布频率有显著差异的snp，作为紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断指标。最后筛选出的与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的snp组成诊断试剂盒(rs2297322和rs6130615)。诊断试剂可以包括这些snp的特异性扩增引物和特异性延伸引物，以及taq酶、dntp等试剂。
7.利用上述紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒检测待筛查的肿瘤患者并与实际临床检测相比较以确定该试剂盒的有效性。具体包括测定受试者血标本cdna中上述snp的特异性扩增引物、特异性延伸引物和其他检测试剂，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的用药指导提供支持。
本发明的有益效果：
本发明通过对肿瘤患者外周血基因组dna的分子标记进行检测，筛选出一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的易感snp标志物，该类生物标志物的成功开发将为紫杉烷类化疗药物骨髓抑制的诊断和控制提供数据支持，有助于实现个体化治疗指导、改善患者的预后，提高临床用药的有效性和安全性。
本发明所述的紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒只需要外周血而不需要其它组织样品，通过特性扩增引物及延伸引物检测snp，再通过snp质谱评价接受紫杉烷类化疗药物的癌症患者的血液毒性反应(毒副反应)，有助于反映患者对紫杉烷类化疗药物骨髓抑制毒性的易患程度，检测方便精确、稳定可靠，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。因此，该试剂盒投入生产实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段是本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
实施例一
本实施例为样品的收集和样品资料的整理。
表2adr组和对照组的临床特点的比较
发明人自2012至2015年从济南市第四人民医院收集了大量的癌症患者血标本，通过对样品资料的整理，从中选择了124例符合下列标准的标本：(1)年龄在18至80岁的癌症患者；(2)无主要脏器的功能障碍，首次化疗前血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；(3)所有患者至少接受基于紫杉醇或多西紫杉醇的化疗一周期；(4)除有骨转移的患者，所有患者基线嗜中性细胞绝对计数大于1.5×109/l；(5)有患者的年龄，性别，身高，体重，肿瘤类型和肿瘤分期等基线信息；(6)有详细的评价药物毒性的信息，记录了每个患者的血细胞计数，包括白细胞计数，嗜中性细胞绝对计数，血小板计数和血红蛋白浓度。上海伦理委员会和中国人类遗传资源管理办公室同意了本实验方法。患者的招募，血样收集，临床数据收集和使用均按相关的指导完成。
符合条件的124例癌症患者分为两组，其中，adr组和对照组的年龄、性别、身高和体重没有显著差异，在肿瘤类型和肿瘤分期方面也没有显著差异。详见上面的表2。
实施例二
本实施例为外周血dna提取、基因型检测及结果分析。具体步骤为：
1.按照说明书使用qiaampdnaminikit从外周血中抽提dna，于1.5ml离心管底部加入20ulqiagenprotease(或proteinasek)溶液，提取200μl新鲜血液加入该离心管中；
2.加入200μlbufferal振荡15s，56℃水浴10min；
3.短时离心，以去除离心管盖内沿液体；
4.加入200μl乙醇(96％～100％)，振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体；
5.将以上所得的混合液(包括沉淀物)加入到qiaamp离心柱中，将离心柱放入2ml收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min，将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体；
6.加入500μlbufferawl到qiaamp离心柱中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min，将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)，丢弃收集管及其中液体；
7.加入500μlbufferaw2到qiaamp离心柱中，盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min；
8.将qiaamp吸附柱置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体，全速离心1min；
9.将qiaamp吸附柱置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体，在qiaamp吸附柱中加入200μlbufferal或蒸馏水，室温下(15～25℃)静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min。将收集管盖好，保存于-20℃。
10.浓度测量：通常能得到20～50ng/μldna，纯度(紫外2600d与2800d比值)在1.8～2.0。
11.测序：
(1)用sequenommassarraysystem对与紫杉烷化疗药物骨髓抑制相关的2个snp设计特异性扩增引物和特异性延伸引物，每个位点有相应的三条引物，包括pcr扩增的前、后引物(1st-pcrp、2nd-pcrp)以及单碱基延伸反应引物(uep_seq)，设计结果参见表1。设计好的引物送至上海捷瑞生物工程有限公司合成。
(2)将合成的扩增引物加去离子水稀释成扩增引物mix，将合成的延伸引物加去离子水稀释成延伸引物mix。
(3)将上述基因组dna样品用去离子水稀释为浓度10～20ng/μl，做好样品标记，分装在96孔板中保存，方便后面384管进行分装；
(4)pcr反应：
在384孔板上做好标记，根据检测的样本数按0.1μldntpmix(25mm),0.5μl10×pcrbuffer,0.4μlmgcl2(25mm)，1μl扩增引物mix，0.2μlhotstartaq(5u/μl)，去离子水1.8μl来配置mix；在384孔板中每孔加入1μl的dna样本，最后再加入4μlmix；封膜，将384板用vortex混匀后甩离；在abi9700pcr仪上进行如下反应：95℃2min；45个循环：95℃30s、56℃30s、72℃60s；72℃5min；4℃hold，反应结束后取出384反应板；
(5)sap消化反应：
取出的384反应板2000rpm离心1min，根据检测的样本数按10×sapbuffer0.17μl,sapenzyme0.3μl,去离子水1.53μl来配置sap酶mix；向384板每孔加入2μl的sap酶mix，封膜，vortex混匀甩离；在pcr仪中进行sap酶消化：37℃40min，85℃5min，4℃hold，消化完毕后取出384孔反应板；
(6)延伸反应：
取出sap反应后的384孔板2000rpm离心1min；根据检测样本数按10×goldbuffer0.2μl，terminationmix0.2μl,延伸引物mix0.94μl，hotstartaq(5u/μl)0.041μl,去离子水0.619μl来配置延伸mix；向384孔每孔中加入2μl的延伸mix，封膜，vortex混匀甩离；在pcr仪上进行下列反应：94℃30s；40个外部循环：94℃5s、5个内部循环(52℃5s,80℃5s)；72℃3min；4℃hold，反应完毕，取出384孔反应板。
(7)树脂纯化、质谱检测：
将384板2000rpm离心2min，每孔加16μl水，封膜，再2000rpm离心2min；向6mg384板的每孔中加入树脂，推平压实，384板压在6mg384板上，两板对调，敲打6mg384板背面，使树脂落入装有延伸产物的384孔板中。封膜，15rpm，15min,上下颠倒两板，使树脂在水中分散好，充分纯化，点样之前2000rpm离心5min。结束后撕膜，使用massarraynanodispenserrs1000点样仪将384板中的反应产物点至spectrochip(sequenom)芯片上，进行malditof质谱分析，检测结果采用typerv4.0软件分型并输出结果。
12、数据分析与处理：通过对snp位点与紫杉烷相关骨髓抑制的相关性分析可知，位于slc15a1的rs2297322对骨髓抑制的影响最大(rec，p<0.01，or＝3.571，95％ci：1.358-9.394)。位于hnf4α的rs6130615显示骨髓抑制风险增高(rec,or＝2.807,95％ci＝1.077-7.316,p＝0.035)。结果参考下面的表3。
表3snp位点与紫杉烷相关骨髓抑制的相关性
实施例三
为进一步验证上述snp对紫杉烷相关的白细胞减少症或中性粒细胞减少症的效应，对严重白细胞减少症或中性粒细胞减少症的患者进行了关联分析。结果显示，slc15a1rs2297322和hnf4αrs6130615与骨髓抑制的发生显著相关。slc15a1rs2297322与增加白细胞减少症和中性粒细胞减少症的风险都有关(rec，or＝2.933，95％ci：1.017-8.464，p＝0.047；rec，or＝3.549，95％ci：1.290-9.763，p＝0.014)。hnf4αrs6130615与增加白细胞减少症的风险显著相关(rec，or＝2.933，95％ci：1.017-8.464，p＝0.047)。两次关联分析中，证实了rs2297322和rs6130615作为紫杉烷相关骨髓抑制的易感位点。
因此，采用rs2297322和rs6130615的组合能够很好地将易发生不同程度骨髓抑制的癌症患者区分。
实施例四
本实施例为紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒的制备。
该试剂盒的制作和操作流程是基于sequenommassarray基因分型平台检测技术。试剂盒含有两个snp的特异性扩增引物和特异性延伸引物，其中特异性扩增引物：rs2297322的扩增引物序列为seqidno:1和seqidno:2；rs6130615的扩增引物序列为seqidno:4和seqidno:5；特异性延伸引物：rs2297322的延伸引物序列为seqidno:3；rs6130615的延伸引物序列为seqidno:6。试剂盒还有相应的pcr技术所需要的常用试剂，如dntp，mgcl2，去离子水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物及延伸引物检测snp，再通过snp谱评价接受紫杉烷类药物化疗的癌症患者骨髓抑制毒副反应，不仅稳定，检测方便、精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。相关引物信息见本说明书中的表1部分。
sequencelisting
<110>济南市第四人民医院
<120>一种与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的snp标志物及其应用
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>snp位点rs2297322的后引物
<400>1
acgttggatgatgacctcacagaccacaac30
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>位点rs2297322的前引物
<400>2
acgttggatgagtgagcaccaactcacacg30
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>位点rs2297322的延伸引物
<400>3
gaatggcacccccgaca17
<210>4
<211>30
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>位点rs6130615的后引物
<400>4
acgttggatgaacacagcagttctgcagag30
<210>5
<211>30
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>位点rs6130615的前引物
<400>5
acgttggatgagccccaagcctcattactc30
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>位点rs6130615的延伸引物
<400>6
cttggggtggatgatataatg21