一种脂溶性抗氧化剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种脂溶性抗氧化剂及其制备方法，属于生物化学领域。

技术背景

表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)是茶叶的成分之一，占茶多酚总量的40％左右，是茶多酚的重要组成成分。egcg是一种白色无定型固体，易溶于水、乙酸乙酯、乙醇，不溶于石油醚、氯仿等有机溶剂，在油脂中溶解度很小。egcg的含量影响茶叶的品质，是茶叶中最具有研究前景的化学成分。

egcg具有多种重要的生理活性，如抗氧化性、抗抑郁、抗流感病毒、抑制淀粉样β蛋白形成、抗癌、预防治疗心血管疾病、钙脱敏剂或调节剂、抗癌蛋白载体等。然而，egcg酚羟基的存在使其具有较低的亲脂性和较高的亲水性，使得egcg不容易透过双脂层细胞膜，难以到达靶向作用点从而大大降低其应有的生理活性。有研究表明，给小鼠口服egcg56mg，只有0.012％被吸收。此外，在生理环境下，egcg的稳定性较差、可有效利用的浓度很低，导致其体内生物利用度不高。

针对以上问题，国内外学者开展了大量研究工作致力于egcg的改性，以增加其脂溶性、稳定性和生物利用度，主要包括物理方法以及利用生物或化学合成的分子修饰方法。如何在改性的同时尽可能的保留其活性基团，如何实现egcg修饰类型的多样性，仍然是茶多酚研究的难点与关注点。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种脂溶性抗氧化剂及其制备方法。本发明脂溶性抗氧化剂通过化学修饰egcg，在保留原有抗氧化活性的同时，较大幅度提高其脂溶性，所获产品可作为特殊抗氧化剂，在食品等领域具有广泛的应用前景。

本发明脂溶性抗氧化剂，其结构式为：

本发明脂溶性抗氧化剂的分子量为642.57，命名为二苯基膦表没食子儿茶素没食子酸酯，是由egcg与氯代二苯基膦反应获得(虚线部分是被修饰基团)。

本发明脂溶性抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：

精确称取egcg于三口烧瓶中，加入乙酸乙酯超声辅助溶解，将三口烧瓶接回流冷凝装置，向反应器内通氮气以排除空气，然后向反应器中加入氯代二苯基膦和催化剂，加热搅拌反应；反应结束后，将反应液用超纯水洗涤，有机相浓缩、重结晶、干燥，获得氯代二苯基膦修饰的egcg。

制备过程中，乙酸乙酯需预先除水，反应过程中需避氧。

所述催化剂为有机碱，包括三乙胺、三乙烯二胺等。

在反应体系中，egcg的浓度为10-20mg/ml，氯代二苯基膦的浓度为1.5-2.5％(v/v)，催化剂的浓度为0.3-0.8％(w/w)。

制备过程中，反应温度为45-55℃，反应时间为4-6小时。

反应结束后需用等体积超纯水洗涤，洗涤次数为三次。

重结晶所用溶剂为乙酸乙酯。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明通过一步合成法制备脂溶性egcg，步骤简单，效率高，选择性好，且能很好地保留egcg的活性。

2、清除自由基实验结果发现修饰egcg具有很高的抗氧化性，实验显示修饰egcg的脂溶性显著提高。本发明是一种新型高效的egcg修饰方法，应用前景十分广阔。

附图说明

图1是修饰前后高效液相色谱(hplc)检测图谱。从图1中可以看出，修饰后的化合物纯度达到99％以上。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，这些具体实施方式仅用来帮助理解本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。

实施例1：

称量0.458gegcg(纯度98％以上)，乙酸乙酯中加无水硫酸钠搅拌、静置过夜，过滤除去固态干燥剂，将称量好的egcg加入除水的30ml乙酸乙酯中，搅拌溶解(可以超声辅助溶解)，待完全溶解后移入预先安装好且通气5min的三口烧瓶中，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中,待反应体系温度升至45℃时，加入538.6μl氯代二苯基和0.4％(w/w底物)三乙胺，开始反应，4h后结束反应，将体系移出，用等体积超纯水洗涤3次，有机相浓缩，重结晶，干燥，收率85.3％。

实施例2：

称量0.413gegcg(纯度98％以上)，乙酸乙酯中加无水硫酸钠搅拌、静置过夜，过滤除去固态干燥剂，将称量好的egcg加入除水的40ml乙酸乙酯中，搅拌溶解(可以超声辅助溶解)，待完全溶解后移入预先安装好且通气5min的三口烧瓶中，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中,待反应体系温度升至50℃时，加入592.5μl氯代二苯基和0.5％(w/w底物)三乙烯二胺，开始反应，5h后结束反应，将体系移出，用等体积超纯水洗涤3次，有机相浓缩，重结晶，干燥，收率86.1％。

实施例3：

称量0.413gegcg(纯度98％以上)，乙酸乙酯中加无水硫酸钠搅拌、静置过夜，过滤除去固态干燥剂，将称量好的egcg加入除水的30ml乙酸乙酯中，搅拌溶解(可以超声辅助溶解)，待完全溶解后移入预先安装好且通气5min的三口烧瓶中，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至55℃时，加入430.3μl氯代二苯基和0.5％(w/w底物)三乙胺，开始反应，6h后结束反应，将体系移出，用等体积稀酸洗涤3次，有机相浓缩，重结晶，干燥，收率85％。

实施例4：

称量0.595gegcg(纯度98％以上)，乙酸乙酯中加无水硫酸钠搅拌、静置过夜，过滤除去固态干燥剂，将称量好的egcg加入除水的50ml乙酸乙酯中，搅拌溶解(可以超声辅助溶解)，待完全溶解后移入预先安装好且通气5min的三口烧瓶中，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至50℃时，加入646.5μl氯代二苯基和0.4％(w/w底物)三乙烯二胺开始反应，5h后结束反应,将体系移出，用等体积稀酸洗涤3次，有机相浓缩，重结晶，干燥，收率87.9％。

实施例5：脂溶性egcg抗氧化能力测试

1、dpph自由基清除活性：

分别配制不同浓度的egcg，实施例1，2，3，4(12.5，25，50，100，200，400，500μg/ml)甲醇溶液，吸取2ml与2mldpph甲醇溶液(0.13mmol/l)混匀，室温孵育30min，在517nm处用紫外分光光度计测定吸光值，每组设三组平行，取平均值，清除dpph自由基能力按：

其中a0：2ml甲醇和2mldpph溶液的混合物所测得的吸光值，a2：2ml不同浓度样品溶液与2mldpph溶液混合测得的吸光值，a1：2ml甲醇与2ml不同浓度样品溶液混合的吸光值。

2、超氧阴离子清除活性：

吸取配制的tris-hcl(50mm，ph值8.3)0.5ml和不同浓度的egcg，实施例1，2，3，4(12.5，25，50，100，200，400，500μg/ml)甲醇溶液，混匀，静置20min，再加0.2ml现配的邻苯三酚(3mmol/l)，成分混匀，在325nm处每30s测定一次吸光值，持续5min，每组设三组平行，取平均值，清除超氧阴离子能力按照：

其中a0：空白对照测得的吸光值，a1：不同浓度样品所测吸光值。

3、羟基自由基清除活性：

配制不同浓度的度的egcg，实施例1，2，3，4(12.5，25，50，100，200，400，500μg/ml)甲醇溶液，向试管中分别加1mlfeso4溶液，1ml乙醇-水杨酸，和1ml样品溶液，震荡，混匀，静置10nin，再加1mlh2o2混匀并且反应30min，结束后，在510nm处测定吸光值，每组设三组平行，取平均值。空白组：甲醇代替样品，对照组：甲醇代替乙醇-水杨酸，清除羟基自由基能力：

其中，a0为空白组吸光值，a2为样品组吸光值，a1：对照组吸光值。

如表1所示，为实施例1-4制备得到的脂溶性egcg的抗氧化性能比较。表1结果表明，本发明1-4制备的脂溶性egcg产物有较强的抗氧化能力。

表1抗氧化性能比较

实施例6：脂溶性能力测试

采用摇瓶-紫外分光光度法，测定脂溶性egcg的油水分配系数(logp)，按正辛醇：超纯水体积比为1：3加入具塞锥形瓶中，摇床振荡24h，静置过夜，两相分开得到水饱和正辛醇和正辛醇饱和水，分别称取egcg，实例1,2,3,4产物5mg，用水饱和的正辛醇溶解并定容至10ml，在280nm处测其吸光值a0，再吸取3ml溶解样品的水饱和的正辛醇溶液与正辛醇饱和水3ml混合，摇床振荡24h，6500r/min离心10min，取正辛醇层，在280nm处测其吸光值ax。按照公式：

logp＝loga0/(ax-a0)

本发明产品实施例1-4与egcg脂溶性比较如下表2。表2结果表明，本发明1-4制备的脂溶性egcg产物，显著提高了其油水分配系数。

表2脂溶性性能比较

实施例7：高效液相色谱(hplc)检测方法

本发明产品实施例1-4与egcg检测条件为：色谱柱：zorbaxsb-c18column(150×4.6mm)柱温度：30℃，波长：280nm，进样量：10μl，流速：1ml/min，a流动相：乙腈：乙酸＝99.8:0.2，流动相b：水：乙酸＝99.8：0.2，洗脱时间和梯度：0-28-50min，流动相a：5％-95％-5％，结果如图1所示。