一种迫呫吨并呫吨的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种迫呫吨并呫吨的制备方法及应用。

背景技术：

光敏剂是一种本身(或其代谢产物)能选择的浓集于要作用细胞的化学物质，它(或其代谢产物)再适当波长光的激发下能产生光动力效应而破环靶细胞。理想的光敏剂应具备结构明确，性质稳定；在光照时具有强的光毒性，对机体无毒副作用；光敏化能力强，三线态氧寿命长；在600-900nm处有强吸收，有利于治疗时采用对人体组织穿透较深的光源且可溶解于生理ph值。但是，目前还没有完全满足这些条件的光敏试剂。

迫呫吨并呫吨是一种稠环芳香化合物，呈现出蓝色荧光，早期应用于工业生产制备化学荧光染料，且迫呫吨并呫吨荧光活性很强，具有空穴传输能力，在空气中具有很高的热稳定性和较高的玻璃化转变温度，故能应用于制备荧光材料。迫呫吨并呫吨作为一种荧光物质，但在抗肿瘤方面的应用目前还未有报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种迫呫吨并呫吨化合物的制备方法及应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种迫呫吨并呫吨的制备方法，包括以下步骤：

1)将联萘酚在铜胺络合物作用下进行氧化反应，得到二苯并[a,kl]呫吨；

2)将二苯并[a,kl]呫吨加热反应，得到结构如式(ⅰ)所示的迫呫吨并呫吨；

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)具体是：

s1：将铜盐溶于溶剂中，得到铜盐溶液；

s2：将胺溶于溶剂中，再与铜盐溶液混合，搅拌至澄清，得到铜胺络合物；

s3：将铜胺络合物与联萘酚的溶液混合，加热进行氧化反应，将固体产物提纯，得到二苯并[a,kl]呫吨。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)中，联萘酚、铜盐中的铜、胺的摩尔比为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)中，氧化反应的温度为40℃～60℃；进一步优选的，氧化反应的温度为45℃～55℃。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)中，氧化反应是用tlc(thinlayerchromatography，薄层色谱)追踪点板至原料消失。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s1中，铜盐为氯化铜、氯化亚铜、溴化铜、硝酸铜、醋酸铜、高氯酸铜中的至少一种；进一步优选的，铜盐为氯化铜、溴化铜、硝酸铜、醋酸铜中的至少一种。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s1中，溶剂为醇类、酯类、醚类、醇醚类、酰胺类溶剂中的至少一种；进一步优选的，溶剂为醇类溶剂；再进一步优选的，溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的至少一种。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s1中，铜盐溶液的浓度为0.1mol/l～0.2mol/l。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s2中，胺与溶剂的用量比为1g：(5～50)ml。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s2中，胺为c10以内的乙醇胺类，脂肪族和芳香族伯胺、仲胺或叔胺类；进一步优选的，胺为乙醇胺。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s2中，溶剂为醇类、酯类、醚类、醇醚类、酰胺类溶剂中的至少一种；进一步优选的，溶剂为醇类溶剂；再进一步优选的，溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的至少一种。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s3中，联萘酚的溶液是指联萘酚的醇溶液、酯溶液或醚溶液；进一步优选的，联萘酚的溶液是指联萘酚的甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇溶液。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤1)s3中，提纯具体为：先旋转蒸发去除溶剂，然后将剩余物溶于乙酸乙酯中，用氨水洗，分液，弃水层；再用水洗，分液，弃水层；用无水硫酸钠干燥；干燥后，过滤，取滤液；再旋转蒸发去除溶剂，用四氢呋喃溶解固体后析出结晶。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤2)中，将二苯并[a,kl]呫吨加热至升华，得到产物。

优选的，这种迫呫吨并呫吨的制备方法步骤2)中，加热的温度为240℃～260℃；进一步优选的，加热的温度为245℃～255℃。

式(ⅰ)所示的迫呫吨并呫吨在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，应用中，肿瘤为肝癌、宫颈癌、肺癌、食道癌、胃癌中的一种或多种。

优选的，应用是在光照下进行。

一种药物组合物，包括式(ⅰ)所示的迫呫吨并呫吨或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药。

优选的，该药物组合物为抗肿瘤药物。

本发明中“药学上可接受的盐”是指把母体化合物中的碱性基团转换成盐的形式。药学上可接受的盐包括，但不仅限于，碱性基团例如胺(氨)基的无机或有机酸盐类。本发明药学上可接受的盐可以由母体化合物合成，即母体化合物中的碱性基团与1-4当量的酸在一个溶剂系统中反应。合适的盐列举在remington’spharmaceuticalsciences,17thed.,mackpublishingcompany,easton,pa.,1985,1418和journalofpharmaceuticalscience,66,2,1977中。

药学上可接受的酸加成盐可以由无机和有机酸制备。由衍生酸加成盐的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。由衍生酸加成盐的有机酸包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苯磺酸等。衍生酸加成盐的无机酸和有机酸尤其选自盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、高氯酸、氢溴酸、乙酸、苯甲酸和对甲苯磺酸。

本发明的化合物和药学上可接受的盐还包括溶剂化物或水合物的形式。一般来说，溶剂化物或水合物的形式与非溶剂化的或非水合的形式等同，并涵盖在本发明的范围内。本发明中的某些化合物有可能存在多晶体或无定形的形式。总的来说，所有的物理形式具有同等的用途，并且涵盖在本发明的范围内。

本发明还包括所述化合物的前药。前药是一个药理物质(药物)，由母体药物衍生而来。一旦进入体内，前药就被代谢转变成母体药物。前药可通过对母体药物的一个或多个官能团进行取代而制备，其取代基团在体内将被降解而释放出母体化合物来。前药的制备和使用可在t.higuchiandv.stella,“pro-drugsasnoveldeliverysystems,”vol.14ofthea.c.s.symposiumseries和bioreversiblecarriersindrugdesign,ed.edwardb.roche,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress,1987中找到。

优选的，这种药物组合物，还包括药学上可接受的辅料。

本发明所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

本发明的有益效果是：

本发明提供了提供一种制备迫呫吨并呫吨化合物的新合成方法，反应条件温和，产物纯度好。本发明得到的迫呫吨并呫吨化合物在光照条件下具有强的抗肿瘤活性ic50可达到nm级别，作为光敏试剂应用于制备抗肿瘤药物具有较好的前景。

附图说明

图1是流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡图；其中，a)为空白对照组；b)为避光组；c)为光照组；

图2是流式细胞仪检测肿瘤细胞中活性氧的水平变化图；其中，a)为空白对照组；b)为避光组；c)为光照组。

具体实施方式

一种迫呫吨并呫吨的制备方法，包括以下步骤：

1)将在铜胺络合物作用下进行氧化反应，得到

2)将加热反应，得到

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

合成实施例

先将0.6g二水合氯化铜加于装有20ml甲醇的锥形瓶中，搅拌至溶解；再将0.2g乙醇胺加于装有5ml甲醇的小烧杯中；将小烧杯中的乙醇胺甲醇溶液在搅拌中加入氯化铜溶液中，搅拌至澄清；继续在搅拌中加入事先溶于甲醇溶液中的1.0g联萘酚(化合物1)，50℃加热搅拌；tlc追踪点板至原料消失；将溶剂旋蒸干，将剩余物溶于乙酸乙酯中，用氨水洗，分液，弃水层，重复三遍；再用水洗，分液，弃水层，重复三遍；用无水硫酸钠干燥；干燥后，过滤，取滤液；旋蒸至无溶剂，用四氢呋喃溶解固体后慢慢析出结晶，得到化合物黄色晶体2，产率92％。

升华：取结晶体化合物2置于小烧杯中，将漏斗倒扣于小烧杯上，漏斗颈口塞一小段棉花，置于电热套中加热至250℃；小心揭开漏斗，得到黄色针状晶体化合物3，产率53％。

迫呫吨并呫吨生物活性检测

1、体外抗癌试验和细胞毒性试验(mtt比色法)

把3×10⁴/ml的细胞株接种于96孔培养板中，每孔加入200μl，用10％mem培养基培养。温箱中培养24h后去掉培养液，加入新配制培养液，并分别加入一系列浓度的待测药物的dmso溶液，每孔加入200μl，加药后暗箱挂白炽灯60w光照1h，每剂量组设三个平行样本，培养48h后每孔加入2mg/ml的mtt溶液20μl，培养40h。完全吸出孔内培养液，各加入150μl的dmso，震荡10分钟使结晶物溶解。用酶联检测仪检测各孔od值(＝490nm)，以od值对药物浓度的对数作图，从而求出令半数细胞死亡的药物浓度即ic50，结果见表1。

表1迫呫吨并呫吨对不同细胞的ic50

表1中，a549：肺癌细胞；eca-109：食管癌细胞；hela：宫颈癌细胞；hepg-2：肝癌细胞；sgc-7901：胃癌细胞；lo2：人类正常干细胞。dark表示避光组，light表示光照组。

由表1可知，迫呫吨并呫吨在没有光照的情况下，对正常细胞及肿瘤细胞均无影响，亦无体外细胞毒性；光照处理后化合物对各肿瘤细胞的ic50值明显减少，从107±2nm到28±2.3nm，表现出较强的体外细胞毒性，尤其是作用于eca-109细胞，ic50下降至28±2.3nm，对人正常肝细胞的ic50值大于各肿瘤细胞的ic50值。由此可以看出迫呫吨并呫吨化合物具备有良好的抗肿瘤活性，具有作为光敏剂应用于治疗肿瘤的前景。

2、诱导肿瘤细胞eca-109凋亡的检测

化合物的抗肿瘤活性与其诱导肿瘤细胞的凋亡有密切关系，为了检测迫呫吨并呫吨是否能诱导肿瘤细胞的凋亡，采用流式细胞仪annexinv-pi双染色法检测化合物作用肿瘤细胞后的凋亡情况，具体操作流程：取对数生长期的eca-109细胞在6孔板接种，等到细胞完全贴壁后，取迫呫吨并呫吨化合物作用24h，同时设置空白组作对照。然后收集细胞，用pbs洗两遍，按细胞凋亡试剂盒说明书流程进行操作，避光染色20min，将其转移至流式管中，用流式细胞仪检测其凋亡状态。

采取流式细胞仪检测迫呫吨并呫吨诱导肿瘤细胞的凋亡，结果如附图1所示。图1中，a)为空白对照组(control)；b)为避光组(dark)；c)为光照组(light)。图1中的q4为存活细胞率，q3为早期凋亡细胞率，q2为晚期凋亡细胞率。

试验结果表明：空白对照组(a)中早期凋亡细胞为0.43％，晚期凋亡为1.42％；加入迫呫吨并呫吨同时避光处理的细胞组(b)中早期凋亡为2.29％；经迫呫吨并呫吨处理并光照细胞组(c)中早期凋亡细胞增加至5.58％，晚期凋亡增加至4.55％，早期凋亡细胞为空白对照组的增加了约12倍，晚期凋亡细胞比空白组增加了约2倍，由此看出迫呫吨并呫胞能够诱导肿瘤细胞eca-109的凋亡，且在光照条件下作用更强。

3、对肿瘤细胞中活性氧ros水平的影响

细胞中的细胞活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)会促进细胞的凋亡，ros的检测是一种利用荧光探针dcfh-da所进行的检测，细胞内的活性氧最终将其氧化成发绿色荧光的dcf。具体步骤：取生长状态良好的eca-109细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后加迫呫吨并呫吨处理24h，预留空白对照孔，药物作用完毕后消化收集细胞于离心管中，加入活性氧检测试剂，37℃下避光染色30min。染色完成，pbs清洗染料，转移至流式管，流式细胞仪上机检测。

流式细胞仪检测肿瘤细胞中活性氧的水平变化检测结果见附图2。图2中，a)为空白对照组(control)；b)为避光组(dark)；c)为光照组(light)。图2中的i表示dcf荧光强度。

检测发现空白对照组细胞(a)dcf荧光强度为10.6，迫呫吨并呫吨避光处理细胞组(b)dcf荧光强度为46.4，比空白组增加了约3.4倍，迫呫吨并呫吨处理并光照细胞组(c)dcf荧光强度为84.6，比空白组增加了约7倍。检测结果说明迫呫吨并呫吨可以显著增加eca-109细胞的活性氧水平，来促进肿瘤细胞凋亡。