基于pH调节的微藻生物膜的快速接种方法与流程

本发明涉及微藻生物膜式培养领域，具体涉及一种基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法。

背景技术：

微藻可利用电厂烟气中的co2作为碳源、利用污水中的氮磷等作为营养物，并以太阳能作为能量来源，通过光合作用合成油脂等能源物质和其他高附加值的产物，一举达到减排除废和生物质能源产出的多重目的。微藻生物膜式培养可减少系统的需水量，有效提高培养系统内的生物质密度，且具有操作稳定、采收方便、高效节能等优势，具有更大的发展及推广潜力。对于生物膜培养，首先是将悬浮液中低浓度的游离微藻细胞接种在载体基质上，之后持续供给碳源和各种营养物质等，使藻细胞分裂增殖生物质积累，最终形成稳定的生物膜。

然而，目前微藻生物膜常用的接种方式几乎都是对微藻采收方法的借鉴应用和延伸。包括涂布法、抽滤法、流动挂膜法、自然沉降法等。涂布法，即是用涂布刷、刮刀等将高浓度的藻泥涂覆在载体基质表面，从而简单快速的完成微藻细胞在大面积载体表面的接种过程。然而，由于该方式涂布不均匀，无法定量，为生产和量化研究都带来了很大的不便。同时，接种所需的高浓度藻泥仍需要借助离心等高能耗的浓缩方法来获得，致使操作过程复杂繁琐，成本增高。基于此，在实验室及小规模的生物膜培养中，常使用抽滤法，将一定浓度的藻液定量快速的抽滤到滤膜上。这样形成的生物膜结构致密附着牢固性好，但是，一方面过于致密的生物膜结构使营养物质的传质阻力增大，不利于生物膜生长，抽滤需要消耗泵功，使成本增加。另一方面，受制于滤膜尺寸和过滤器尺寸，这种方法通常只在实验室研究和小规模精细培养中使用，无法大规模的推广。因此为降低对设备的依赖，流动挂膜法被应用于微藻生物膜的接种过程。流动挂膜法是使藻液流过载体基质表面，通过细胞与载体基质之间的作用力使一定量的藻细胞附着在载体表面。这种方式对基质材料选择和流动条件控制要求较高，仍不能作为一种普遍的接种方法进行推广应用。

鉴于以上方法存在的问题，沉降接种法开始受到重视。沉降法使悬浮液中的藻细胞定量地沉降在面积较大的载体基质上，其受基质性质影响较小，且不受水力剪切力。然而，由于微藻细胞较小(2-30μm)，密度与水相近，造成下降速度低，自然沉降接种过程通常需要持续6-24小时甚至更长，造成微藻培养时间成本增高。因此，提高微藻细胞的沉降速度，缩短沉降接种时间，对微藻生物膜培养技术的发展和推广具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：选取一种纤维丝状的藻种，作为待接种藻种所需的辅助藻种。

步骤二：在光生物反应器中对待接种藻种和辅助藻种这两个藻种分别进行活化和预培养，并取细胞活性较好的对数期微藻细胞用于接种。

步骤三：将待接种藻种和辅助藻种这两个藻种以一定比例混合，形成藻-藻共聚体悬浮液，混合比例由具体藻种决定。

步骤四：将藻-藻共聚体悬浮液，分别用酸、碱溶液进行ph调节，分别调节藻-藻共聚体悬浮液的ph到酸性和碱性；并且当得到的酸性藻-藻共聚体悬浮液的zeta电位为正，得到的碱性藻-藻共聚体悬浮液的zeta电位为负时，完成对酸性藻-藻共聚体悬浮液和碱性藻-藻共聚体悬浮液的ph调节。

不同的藻种，对应zeta电位为正和zeta电位为负的ph值会不同。

步骤五：再将步骤四得到的等体积的酸性藻-藻共聚体悬浮液和碱性藻-藻共聚体悬浮液混合，并接种到待接种的微藻生物膜培养系统中。

步骤六：几分钟后，悬浮液中的微藻细胞95％以上均沉降到生物膜载体上，接种过程完成。

根据本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法的优选方案，所述待接种藻种用于得到高多糖产物时，辅助藻种选择蓝藻属藻种，包括颤藻或螺旋藻。

根据本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法的优选方案，所述待接种藻种用于得到高蛋白质产物时，辅助藻种选择绿藻属藻种，包括镰形纤维藻。

根据本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法的优选方案，将待接种藻种和辅助藻种这两个藻种以一定比例混合，该混合比例通过如下方法确定：将这两个藻种以不同比例混合，测试其沉降特性，比如测其沉降速度、沉降效率等，当沉降特性最好时对应的混合比例确定为两藻种的最佳混合比例。

根据本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法的优选方案，步骤四：将藻-藻共聚体悬浮液，分别用酸、碱溶液进行ph调节，分别调节藻-藻共聚体悬浮液的ph到酸性和碱性，并且当得到的酸性藻-藻共聚体悬浮液的zeta电位为正，得到的碱性藻-藻共聚体悬浮液的zeta电位为负时，完成对酸性藻-藻共聚体悬浮液和碱性藻-藻共聚体悬浮液的ph调节；具体为：

用浓度为1m的hcl溶液改变藻-藻共聚体悬浮液的ph值，得到酸性藻-藻共聚体悬浮液，同时测试酸性藻-藻共聚体悬浮液在不同ph值下的zeta电位变化，当zeta电位达到正时，完成对该酸性藻-藻共聚体悬浮液的ph值的调节。

再取藻-藻共聚体悬浮液用浓度为1m的naoh溶液去改变藻-藻共聚体悬浮液的ph值，得到碱性藻-藻共聚体悬浮液；同时测试碱性藻-藻共聚体悬浮液在不同ph值下的zeta电位变化，当zeta电位达到负时，完成对该碱性藻-藻共聚体悬浮液的ph值的调节。

本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法的有益效果是：本发明通过构建藻-藻共聚体和调控ph改变zeta电位的方式，使悬浮微藻细胞快速形成较大的絮体，从而沉降速度加快，使微藻生物膜培养系统的接种时间大大缩短；本发明不但可简化接种工序，更可极大缩短接种时间，提高接种量，从而算短生产周期。可广泛应用在微生物培养与发酵、污水处理、物质分析等领域。

附图说明

图1是本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法流程示意图。

图2是本发明所述的基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法的技术原理示意图。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

参见图1，实施例1：基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法，包括如下步骤：

步骤一：选取一种符合实验或生产要求的纤维丝状的藻种，作为待接种藻种所需的辅助藻种。

步骤二：在光生物反应器中对待接种藻种和辅助藻种这两个藻种分别进行活化和预培养，并取细胞活性较好的对数期微藻细胞用于接种。

步骤三：将待接种藻种和辅助藻种这两个藻种以一定比例混合，形成藻-藻共聚体悬浮液，混合比例由具体藻种决定；混合比例通过如下方法确定：将这两个藻种以不同比例混合，测试其沉降特性，比如测其沉降速度、沉降效率等，当沉降特性最好时对应的混合比例确定为两藻种的最佳混合比例。

步骤四：将藻-藻共聚体悬浮液，分别用酸、碱溶液进行ph调节，分别调节藻-藻共聚体悬浮液的ph到酸性和碱性；并且当得到的酸性藻-藻共聚体悬浮液的zeta电位为正，得到的碱性藻-藻共聚体悬浮液的zeta电位为负时，完成对酸性藻-藻共聚体悬浮液和碱性藻-藻共聚体悬浮液的ph调节。不同的藻种，对应zeta电位为正和zeta电位为负的ph值会不同。具体为：

用浓度为1m的hcl溶液改变藻-藻共聚体悬浮液的ph值，得到酸性藻-藻共聚体悬浮液，同时测试酸性藻-藻共聚体悬浮液在不同ph值下的zeta电位变化，当zeta电位达到正时，完成对该酸性藻-藻共聚体悬浮液的ph值的调节；

再取藻-藻共聚体悬浮液用浓度为1m的naoh溶液去改变藻-藻共聚体悬浮液的ph值，得到碱性藻-藻共聚体悬浮液；同时测试碱性藻-藻共聚体悬浮液在不同ph值下的zeta电位变化，当zeta电位达到负时，完成对该碱性藻-藻共聚体悬浮液的ph值的调节。

步骤五：再将等体积的酸性藻-藻共聚体悬浮液和碱性藻-藻共聚体悬浮液混合，并接种到待接种的微藻生物膜培养系统中。

步骤六：几分钟后，悬浮液中的微藻细胞95％以上均沉降到生物膜载体上，接种过程完成。

在具体实施例中，当所述待接种藻种用于得到高多糖产物时，辅助藻种可选择蓝藻属藻种，具体可以选择颤藻或螺旋藻。

当所述待接种藻种用于得到高蛋白质产物时，辅助藻种可选择绿藻属藻种，具体可以选择镰形纤维藻。

实施例2.基于ph调节的微藻生物膜的快速接种方法，包括如下步骤：

步骤一：选取纤维丝状的镰形纤维藻作为辅助藻种，待接种藻种为椭球状斜生栅藻。

步骤二：在将这两个藻种分别接种在光生物反应器中，通入一定浓度的co2作为碳源，加入氮、磷等营养物质作为培养基，在一定光照强度下进行预培养，并取细胞活性较好的对数期微藻细胞用于接种。

步骤三：分别取一定量的椭球状斜生栅藻和镰形纤维藻，先将这两个藻种以不同比例混合，测试其沉降特性，比如测试沉降速度、沉降效率等，当椭球状斜生栅藻和镰形纤维藻的混合比例为1:4时，沉降特性最好，确定为这两藻种的最佳混合比例；再将这两个藻种以最佳混合比例混合，形成藻-藻共聚体悬浮液。

步骤四：用浓度为1m的hcl溶液改变藻-藻共聚体悬浮液的ph值，得到酸性藻-藻共聚体悬浮液，并测试酸性藻-藻共聚体悬浮液在不同ph值下的zeta电位变化，当ph值为2时，zeta电位达到正，完成对酸性藻-藻共聚体悬浮液ph值的调节；再取藻-藻共聚体悬浮液用浓度为1m的naoh溶液改变藻-藻共聚体悬浮液的ph值，得到碱性藻-藻共聚体悬浮液，并测试碱性藻-藻共聚体悬浮液在不同ph值下的zeta电位变化，当ph为9时，zeta电位达到负，完成对碱性藻-藻共聚体悬浮液ph值的调节。

步骤五：再将步骤四得到的等体积的酸性藻-藻共聚体悬浮液和碱性藻-藻共聚体悬浮液混合，并接种到待接种的微藻生物膜培养系统中。

步骤六：1.5分钟后，悬浮液中的微藻细胞95％以上均沉降到生物膜载体上，接种过程完成。

实施例3：与实施例2不同的是：

选取纤维丝状的镰形纤维藻作为辅助藻种，待接种藻种为球状的普通小球藻。而镰形纤维藻与球状的普通小球藻的最佳混合比例为4：1。

根据实施例2与实施例3，说明最佳混合比例与微藻细胞的形态和尺寸有关。并且在微藻光生物反应器中的沉降接种时间由4小时缩短到1.5分钟。

参见图2，本发明的技术原理如下：

藻细胞在沉降过程中，受自身重力、浮力、曳力的合力作用，细胞的沉降速度与其尺寸及密度相关。本发明主要通过构建藻-藻共聚体和调控ph改变zeta电位的方式，使悬浮微藻细胞快速形成较大的絮体，从而沉降速度加快，使微藻生物膜培养系统的接种时间大大缩短。

纤维丝状的藻种，在静电引力范德华力和氢键力的作用下，一端吸附了分散分布的球状等其他形状的微藻细胞后，另一端又吸附了另一微藻，从而把分散的微藻细胞连接起来而形成较大的共聚体；从物理结构来说，丝状微藻可将分散的细胞体缠绕在一起，形成多层多孔的藻-藻共聚体。同时，每个絮体之间又能通过lewis酸-碱水合作用力中的疏水引力及吸附架桥原理的综合作用，使藻细胞能相互靠近到达第一低位穴能，从而紧密地粘结在一起，进一步增大单个絮体的尺寸，从而使微藻絮体沉降速度增大，缩短接种时间。

此外，由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的反号离子，这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散层，与附着在离子表面的电荷形成的stern层共同组成双电层。当分散粒子在外电场的作用下，stern层和扩散层发生相对位移时的滑动面对远离界面的流动体中的某点的电位称为zeta电位。zeta电位(zetapotential)又叫电动电位或电动电势，是表征胶体分散系稳定性的重要指标。zeta电位值可对悬浮液中颗粒团聚或沉降的稳定性进行表征和研究。zeta电位绝对值越高，粒子之间的静电排斥力越大，分散系越稳。通常情况下，当ph在过酸性时，藻-藻共聚体的zeta电位为正，当ph在碱性时，藻-藻共聚体的zeta电位为负，当其混合时，正电性的共聚体可以中和负电性的共聚体，从而降低或消除静电斥力，在桥架作用将负电性的颗粒连结在一起形成较大的絮体，很快打破分散系的稳定性，使藻-藻共聚体迅速沉降。且用ph值稍高的藻液中和过酸藻液，可保护藻细胞，不在过酸环境下失活。由于沉降过程时间极短，强酸性环境不会影响微藻细胞活性。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。