快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的编码基因及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的编码基因及其应用。
背景技术：
：半纤维素中含量最高的为木聚糖，它的完全水解需要多种酶共同协同作用才能完成，其中最主要的包括内切木聚糖酶(ec3.2.1.8)和木糖苷酶(ec3.2.1.37)。内切木聚糖酶能够切开木聚糖的主链以生成长度不均一的木寡糖，而木寡糖则可以通过木糖苷酶进一步的水解作用生成木糖，木糖可以被树干毕赤酵母或者经改造的酿酒酵母利用而生产乙醇。糖苷水解酶家族43(gh43)(http://www.cazy.org)主要含有β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切α-l-聚阿拉伯糖酶和1,3-β-半乳糖苷酶活性，其中具有β-木糖苷酶的数量较多，且常为多功能酶，多种不同酶活协同发挥作用，在半纤维素降解方面具有广泛的应用前景。虽然和木聚糖水解有关的多功能酶已有报道，但是能够高效水解木聚糖生成单一产物木糖的同时发挥β-木糖苷酶、β-木聚糖酶和α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶没有报道。技术实现要素：本发明的发明人在研究中发现，具有如seqidno：2所示的氨基酸序列的糖苷水解酶同时具备β-木糖苷酶、β-木聚糖酶和α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活，同时还能够快速水解木聚糖生成单一木糖，但现有编码seqidno：2所示的氨基酸序列的糖苷水解酶的基因表达水平较低，无法大量获得具有如seqidno：2所示的氨基酸序列的糖苷水解酶。为了能够大量获得具有如seqidno：2所示的氨基酸序列的糖苷水解酶，第一方面，本发明提供了一种编码快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。第二方面，本发明提供了一种含有如上所述的基因的重组载体。第三方面，本发明提供了一种含有如上所述的重组载体的重组菌株。第四方面，本发明提供了一种制备快速水解木聚糖生成木糖的糖苷水解酶的方法，该方法包括以下步骤：(1)培养如上所述的重组菌株，诱导编码快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的基因的表达；(2)分离提纯所表达的糖苷水解酶。第五方面，本发明提供了如上所述的基因、如上所述的载体、如上所述的重组菌种、如上所述的方法制备的糖苷水解酶、如seqidno：1所示的快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶或含有如上所述的方法制备的糖苷水解酶或如seqidno：1所示快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的组合物在发挥内切β-木聚糖酶和/或α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶活性中的应用。第六方面，本发明提供了如上所述的基因、如上所述的载体、如上所述的重组菌种、如上所述的方法制备的糖苷水解酶、如seqidno：1所示的快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶或含有如上所述的方法制备的糖苷水解酶或如seqidno：1所示快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的组合物在水解木聚糖生成单一木糖中的应用。本发明的提供的如seqidno：2所示的核酸能够在酵母中大量表达，从而能够大量获得糖苷水解酶ttxy43，本发明的发明人通过实验验证发现，糖苷水解酶ttxy43同时具有β-木糖苷酶、内切β-木聚糖酶和α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶三种酶的活性。ttxy43的β-木糖苷酶酶活最适反应ph为5.0-7..0，最适反应温度为45-55℃；内切β-木聚糖酶酶活最适反应ph为6.0-9.0，最适反应温度为50-65℃；α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活最适反应ph为5.0-8.0，最适反应温度为45-55℃。此外，本发明的ttxy43中β-木糖苷酶酶活耐受产物木糖的抑制作用，当木糖浓度达到0.2m时，β-木糖苷酶相对酶活性大于40％，而木糖不影响内切β-木聚糖酶酶活。进一步的，本发明的ttxy43酶能直接降解桦木木聚糖生成单一产物木糖，并且与商业化的内切β-木聚糖酶和β-木糖苷酶组合相比较，木糖产量更高，更具有商业应用价值。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为毕赤酵母表达外源蛋白ttxy43的sds-page结果，其中m为蛋白质marker，1为外源蛋白ttxy43；图2为ph对ttxy43的三种酶活的影响，图2a：β-木糖苷酶，图2b：内切β-木聚糖酶，图2c：α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶；图3为温度对ttxy43的三种酶活的影响，图3a：β-木糖苷酶，图3b：内切β-木聚糖酶，图3c：α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶；图4为木糖浓度对ttxy43中β-木糖苷酶和内切β-木聚糖酶的酶活的影响；图5为标准品木寡糖hplc结果；图6为ttxy43和商业化的酶水解桦木木聚糖的hplc结果，图6a：桦木木聚糖，图6b：商业化内切β-木聚糖酶水解结果，图6c：商业化内切β-木糖苷酶水解结果，图6d：ttxy43水解结果与商业化内切β-木聚糖酶+β-木糖苷酶混合酶降解结果对比。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本发明提供一种编码快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。seqidno：2：atggctccattgatcaccaacatcttcaccgctgacccatctgctcacgttttcgagggtaagttgttcatctacccatctcacgacagagagaccgacatcaagttcaacgacgacggtgaccaatacgacatggttgactaccacgttttctctaccgagtctttggacccagctgctccagttaccgaccacggtgttgttttgagagctgaggacgttccatgggtttctaagcaattgtgggctccagacgctgcttacaaggacggtagatactacttgtacttcccagctagagacaagcaaggtgttttcagaatcggtgttgctgttggtgacagaccagagggtccattcaccccagacccagagccaatcagagactcttactctatcgacccagctgttttcgttgacgacgacggtagagcttacatgtacttcggtggtttgtggggtggtcaattgcaatgttaccaaaagggtaacggtatcttcgacccagagtggttgggtccaagagagccatctggtgagggtgttagagctttgggtccaagagttgctagattggctgacgacatgagacaattcgcttctgaggttaaggagatctctatcttggctccagagaccggtgagccaatcgctgctgacgaccacgacagaagattcttcgaggctgcttggatgcacaagtacgacggtaagtactacttctcttactctaccggtgacacccactacttggtttacgctgttggtgactctccatacggtccattcacctacgctggtagaatcttggagccagttttgggttggaccacccaccactctatcgttgagttccacggtagatggtggttgttccaccacgactgtgagttgtctggtggtgttgaccacttgagatctgttaaggttaaggagatcttctacgacaaggacggtaagatcgttaccgagaagccagagtaa根据本发明，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有表1所示的标签的编码序列。表1标签残基数氨基酸序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrr(seqidno：3)poly-his2-10(通常为6个)hhhhhh(seqidno：4)flag8dykddddk(seqidno：5)strep-tagⅱ8wshpqfek(seqidno：6)c-myc10eqkliseedl(seqidno：7)本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(pcr)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用pcr进行扩增获得有关序列。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。第二方面，本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。根据本发明，所述重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选ppiczαa质粒。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(对于ppiczαa质粒，可用ecori和kpni等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用ecori和kpni双酶切ppiczαa及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体ppiczαa-ttxy43。第三方面，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株含有如上所述的基因或如上所述的重组载体。可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆菌(如大肠杆菌(escherichiacoli)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis))或酵母菌(如毕赤酵母(pichiapastoris)或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae))，更优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)。第四方面，本发明提供了一种制备快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的方法，该方法包括：(1)培养如上所述的重组菌株，诱导编码快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的基因的表达；(2)分离提纯所表达的糖苷水解酶。根据本发明，所述培养条件为常规的培养条件，如使用bmgy液体培养基(例如，含有酵母提取物1％，蛋白胨2％，酵母基础氮源1.34％，100mmph6.0磷酸缓冲液，甘油1％)，在25-30℃下培养至过夜；然后再在bmmy培养基(例如，酵母提取物1％，蛋白胨2％，酵母基础氮源1.34％，100mmph6.0磷酸缓冲液，甲醇0.5％)中继续培养，每隔20-28h加入0.8-1.2体积％的甲醇，培养100-150h，离心得到上清即为ttxy43粗酶液。所述粗酶液还可以采用本领域公知的方法进行纯化，从而得到纯化的ttxy43酶。第五方面，本发明提供了如上所述的基因、如上所述的载体、如上所述的重组菌种、如上所述的方法制备的糖苷水解酶、如seqidno：1所示的快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶或含有如上所述的方法制备的糖苷水解酶或如seqidno：1所示快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的组合物在发挥内切β-木聚糖酶和/或α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶活性中的应用。第六方面，本发明提供了如上所述的基因、如上所述的载体、如上所述的重组菌种、如上所述的方法制备的糖苷水解酶、如seqidno：1所示的快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶或含有如上所述的方法制备的糖苷水解酶或如seqidno：1所示快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的组合物在水解木聚糖生成单一木糖中的应用。seqidno：1(糖苷水解酶ttxy43)：maplitniftadpsahvfegklfiypshdretdikfnddgdqydmvdyhvfstesldpaapvtdhgvvlraedvpwvskqlwapdaaykdgryylyfpardkqgvfrigvavgdrpegpftpdpepirdsysidpavfvdddgraymyfgglwggqlqcyqkgngifdpewlgprepsgegvralgprvarladdmrqfasevkeisilapetgepiaaddhdrrffeaawmhkydgkyyfsystgdthylvyavgdspygpftyagrilepvlgwtthhsivefhgrwwlfhhdcelsggvdhlrsvkvkeifydkdgkivtekpe根据本发明，还可以对seqidno：1所示的糖苷水解酶ttxy43进行修饰得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的糖苷水解酶ttxy43没有氨基酸序列上的差异，也即不影响序列的修饰形式上的差异。修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。如上所述的，为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对本发明提供的糖苷水解酶ttxy43进行添加修饰，举例来说，可以通过在本发明提供的糖苷水解酶ttxy43的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的糖苷水解酶ttxy43的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。上述糖苷水解酶ttxy43可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。根据本发明，优选的，以所述组合物的总重量为基准，所述糖苷水解酶的含量为1-10重量％。根据本发明，所述组合物中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂(如铁离子fe2+和锰离子mn2+)等。本发明中，使用所述糖苷水解酶降解木聚糖的方法可以包括：将木聚糖样品与所述糖苷水解酶孵育。相对于每克的以木聚糖计的木聚糖样品，所述糖苷水解酶的用量可以为24-240u。所述接触的条件可以包括：温度为45-55℃，ph值为6-10。所述孵育的时间可以为5-360min。为了获得更佳的降解效果，优选地，所述接触在fe2+和/或mn2+的存在下进行。所述木聚糖样品可以为各种来源的木聚糖，如榉树木聚糖、桦木木聚糖、苎麻木聚糖、玉米芯木聚糖等。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例中用于毕赤酵母表达菌株pichiapastorisx-33和表达载体ppiczαa购自invitrogen公司。酶类及其他生化试剂：限制性内切酶ecori和kpni以及t4连接酶均购自takara公司，pnpx(对硝基-β-d-吡喃木糖苷)、pnpaf(对硝基-α-l-阿拉伯糖苷)、桦木木聚糖、商业化内切β-木聚糖酶购自sigma公司，商业化β-木糖苷酶、标准品木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖购自megazyme公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买)。培养基：大肠杆菌培养基lc：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，nacl0.5％，配制固体培养基时添加1.5％琼脂粉；毕赤酵母培养基ypd：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％；bmgy培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，酵母基础氮源1.34％，100mmph6.0磷酸缓冲液，甘油1％；毕赤酵母诱导表达培养基bmmy：酵母提取物1％，蛋白胨2％，酵母基础氮源1.34％，100mmph6.0磷酸缓冲液，甲醇0.5％。实施例1本实施例用于说明含有本发明的ttxy43基因的重组菌株的构建。(1)ttxy43基因的获得合成seqidno：2所示的核酸序列。设计特异性引物ttxy43-f/ttxy43-rttxy43-f：cggaattcatggctccattgatcaccaa(seqidno：8)ttxy43-r：ggggtaccttactctggcttctcggta(seqidno：9)以seqidno：2所示的核酸序列为模板，ttxy43-f/ttxy43-r为引物进行pcr扩增，pcr的反应参数为：95℃变性5min，然后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸，30个循环后72℃继续延伸10min，得到ttxy43基因片段(seqidno：2)。(2)构建重组菌株利用限制性内切酶ecori和kpni分别酶切ttxy43基因片段和ppiczαa质粒，回收片段，利用t4连接酶连接，得到重组质粒(ppiczαa-ttxy43)，然后将得到的重组质粒转化到毕赤酵母pichiapastorisx-33中，获得重组酵母菌株。转化的方法：取1ml毕赤酵母菌液接种到50mlypd液体培养基中，28℃、200rpm培养至od600到1.3-1.5。4℃条件下4000g离心5min后，倒掉上清收集毕赤酵母菌体，再用50ml预冷的无菌水重悬菌体。相同条件下离心收集菌体，再用25ml预冷的无菌水重悬菌体。相同条件下离心收集菌体，再加入1ml预冷的1m山梨醇，重悬菌体。取80μl菌悬液到预冷的1.5ml离心管中，再加入10μl转化的质粒，混合均匀，转移至2mm电转杯中，冰上预冷5min。将电转杯外壁的水擦拭干净，放入电转仪中，1500v条件下电击。电击结束后迅速加入800μl预冷的1m山梨醇，重悬菌液并转移至2ml离心管中，28℃条件下静置复壮1h，获得重组酵母菌株。(3)重组菌株的验证将转化后的重组酵母菌株涂布在含有博莱霉素(100μg/ml)抗性的ypd平板上，28℃温箱中培养至单菌落出现。挑取单菌落于100μl0.2mliaco和1％sds的混合液中充分悬浮，70℃加热5min，再加入300μl无水乙醇，利用涡旋震荡仪充分混匀，12000rpm离心5min，去除上清，再加入600μl70％乙醇，利用涡旋震荡仪充分混匀，12000rpm离心2min，尽量将上清去除干净，再加入20μlddh2o重悬菌体，12000rpm离心30s，上清为毕赤酵母基因组dna。以上述获得的毕赤酵母基因组dna为模板，特异性引物5’aox(gactggttccaattgacaagc，seqidno：10)和3’aox(gcaaatggcattctgacatcc，seqidno：11)为引物进行pcr验证，pcr的反应参数为：95℃变性5min，然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸，30个循环后72℃继续延伸10min。获得正确表达ttxy43的重组酵母菌株。对比例1本对比例用于说明含有现有的ttxy43基因的重组菌株的构建。按照实施例1的方法进行重组酵母菌株的构建，不同的是，ttxy43基因的核苷酸序列如seqidno：8所示。测试例1本测试例用于说明ttxy43的诱导表达。挑取ypd平板上生长的新鲜的正确表达ttxy43的实施例1和对比例1重组酵母菌株，并将他们分别接种于bmgy培养基中，28℃、200rpm培养过夜，然后转移至1ml培养液于50mlbmmy培养基中，每隔24h加入1％甲醇，培养120h，离心得到上清为ttxy43粗酶液。将所述ttxy43粗酶液进行sds-page电泳，结果如图1所示，其中m为蛋白质marker，1为本发明提供的基因编码的外源蛋白ttxy43；结果显示，本发明提供的ttxy43能够在重组酵母中进行大量表达，且上清液中蛋白纯度较高，而seqidno：12所示基因编码的外源蛋白ttxy43的表达量极低(结果未示出)，由此说明本发明提供的基因编码能够提高目的蛋白的表达量。测试例2本测试例用于说明ttxy43不同酶活性质分析。ttxy43各酶活测定方法(1)β-木糖苷酶：用ph6.0、100mm的磷酸缓冲液配制10mmpnpx(对硝基-β-d-吡喃木糖苷)，于1.5ml离心管中加入100μl底物(10mmpnpx)，再加入100μl的粗酶液，迅速混合均匀，50℃条件下反应10min，加入100μl1mna2co3终止反应，以缓冲液反应体系为空白对照测定od410。1u定义为最适反应条件下(ph6.0，温度50℃)，每分钟产生1μmolpnp所需的酶量。(2)内切β-木聚糖酶：用ph7.0、100mm磷酸缓冲液配制1％桦木木聚糖，在1.5ml离心管中加入100μl1％桦木木聚糖再加入100μl的酶液，迅速混合均匀，50℃条件下反应10min，加入50μl1mnaoh，150μldns终止反应，沸水浴5min，迅速置于冰上冷却，以缓冲液反应体系为空白对照测定od540。1u定义为最适反应条件下(ph7.0,温度60℃),每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量。(3)α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶：用ph7.0、100mm磷酸缓冲液配制10mmpnpaf，在1.5ml离心管中加入100μl10mmpnpaf，再加入100μl的酶液，迅速混合均匀，50℃条件下反应10min，加入100μl1mna2co3终止反应，以缓冲液反应体系为空白对照测定od410。1u定义为最适反应条件下(ph7.0,温度50℃)，每分钟产生1μmolpnp所需的酶量。1、ttxy43三种酶活最适ph测定利用不同ph的磷酸缓冲液测定ph对ttxy43三种酶活的影响，结果如图2a-2c所示，表明：β-木糖苷酶、内切β-木聚糖酶和α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应ph都为7.0。2、ttxy43三种酶活最适温度测定在20-70℃温度条件下每隔10℃测定ttxy43三种酶活，结果如图3a-3c所示，结果表明：β-木糖苷酶最适反应温度为50℃，内切β-木聚糖酶最适反应温度为60℃，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶最适反应温度为50℃。3、不同金属离子对ttxy43三种酶活影响在最适反应条件下，在反应体系中加入一定浓度的金属离子，测定ttxy43三种不同的酶活，结果如下表2所示，fe2+和mn2+对ttxy43各酶活均有促进作用。表2浓度内切β-木聚糖酶β-木糖苷酶α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶control100±4.3100±4.2100±4.6mg2+5mm74.3±6.564.6±4.5100.3±5.3ca2+5mm140.1±3.7102.0±2.495.5±5.2co2+5mm74.6±1.250.4±1.2103.8±6.3fe2+5mm141.6±3.1121.4±3.1114.3±4.0mn2+5mm160.7±7.0118.2±6.8125.2±3.1ni2+5mm32.5±3.693.3±4.683.2±4.1zn2+5mm55.8±1.510.0±1.110.0±2.2cu2+5mm30.6±3.312.0±3.122.0±3.1edta5mm18.9±3.120.6±3.726.6±2.6tween201％79.1±2.258.0±2.860.0±3.6sds1％31.8±2.27.0±2.910.0±1.24、不同浓度木糖对β-木糖苷酶和内切β-木聚糖酶酶活影响标准品木糖浓度在0-1000mm之间每隔100mm测定其对β-木糖苷酶和内切β-木聚糖酶酶活的影响，结果如图4所示，结果表明随着标准品木糖浓度的升高，β-木糖苷酶的酶活逐渐下降，当浓度为1000mm时，其酶活接近于零，而木糖不影响内切β-木聚糖酶的酶活。测试例3本实施例用于说明ttxy43水解桦木木聚糖结果分析。以1％重量桦木木聚糖为底物，分别利用ttxy43、商业化内切β-木聚糖酶、商业化β-木糖苷酶、商业化内切β-木聚糖酶和β-木糖苷酶混合酶在最适反应条件下(ph7.0,温度50℃)进行水解，水解后离心，上清利用岛津lc-20ahplc系统，选用有机酸柱roa-organicacidh+(8％)(phenomenex)进行分析标准品木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的生成情况，结果如图6所示(图6a：桦木木聚糖，图6b：商业化内切β-木聚糖酶水解结果，图6c：商业化内切β-木糖苷酶水解结果，图6d：ttxy43水解结果与商业化内切β-木聚糖酶/β-木糖苷酶混合酶降解结果对比)，结果表明ttxy43和商业化的酶相比，降解桦木木聚糖生成产物为单一的木糖。标准品木寡糖hplc结果如图5所示。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。sequencelisting<110>中国农业大学<120>快速水解木聚糖生成单一木糖的糖苷水解酶的编码基因及其应用<130>i55672nyd<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>327<212>prt<213>糖苷水解酶ttxy43<400>1metalaproleuilethrasnilephethralaaspproseralahis151015valphegluglylysleupheiletyrproserhisasparggluthr202530aspilelyspheasnaspaspglyaspglntyraspmetvalasptyr354045hisvalpheserthrgluserleuaspproalaalaprovalthrasp505560hisglyvalvalleuargalagluaspvalprotrpvalserlysgln65707580leutrpalaproaspalaalatyrlysaspglyargtyrtyrleutyr859095pheproalaargasplysglnglyvalpheargileglyvalalaval100105110glyaspargprogluglyprophethrproaspprogluproilearg115120125aspsertyrserileaspproalavalphevalaspaspaspglyarg130135140alatyrmettyrpheglyglyleutrpglyglyglnleuglncystyr145150155160glnlysglyasnglyilepheaspproglutrpleuglyproargglu165170175proserglygluglyvalargalaleuglyproargvalalaargleu180185190alaaspaspmetargglnphealasergluvallysgluileserile195200205leualaprogluthrglygluproilealaalaaspasphisasparg210215220argphepheglualaalatrpmethislystyraspglylystyrtyr225230235240phesertyrserthrglyaspthrhistyrleuvaltyralavalgly245250255aspserprotyrglyprophethrtyralaglyargileleuglupro260265270valleuglytrpthrthrhishisserilevalgluphehisglyarg275280285trptrpleuphehishisaspcysgluleuserglyglyvalasphis290295300leuargservallysvallysgluilephetyrasplysaspglylys305310315320ilevalthrglulysproglu325<210>2<211>984<212>dna<213>糖苷水解酶ttxy43编码基因<400>2atggctccattgatcaccaacatcttcaccgctgacccatctgctcacgttttcgagggt60aagttgttcatctacccatctcacgacagagagaccgacatcaagttcaacgacgacggt120gaccaatacgacatggttgactaccacgttttctctaccgagtctttggacccagctgct180ccagttaccgaccacggtgttgttttgagagctgaggacgttccatgggtttctaagcaa240ttgtgggctccagacgctgcttacaaggacggtagatactacttgtacttcccagctaga300gacaagcaaggtgttttcagaatcggtgttgctgttggtgacagaccagagggtccattc360accccagacccagagccaatcagagactcttactctatcgacccagctgttttcgttgac420gacgacggtagagcttacatgtacttcggtggtttgtggggtggtcaattgcaatgttac480caaaagggtaacggtatcttcgacccagagtggttgggtccaagagagccatctggtgag540ggtgttagagctttgggtccaagagttgctagattggctgacgacatgagacaattcgct600tctgaggttaaggagatctctatcttggctccagagaccggtgagccaatcgctgctgac660gaccacgacagaagattcttcgaggctgcttggatgcacaagtacgacggtaagtactac720ttctcttactctaccggtgacacccactacttggtttacgctgttggtgactctccatac780ggtccattcacctacgctggtagaatcttggagccagttttgggttggaccacccaccac840tctatcgttgagttccacggtagatggtggttgttccaccacgactgtgagttgtctggt900ggtgttgaccacttgagatctgttaaggttaaggagatcttctacgacaaggacggtaag960atcgttaccgagaagccagagtaa984<210>3<211>5<212>prt<213>poly-arg标签<400>3argargargargarg15<210>4<211>6<212>prt<213>poly-his标签<400>4hishishishishishis15<210>5<211>8<212>prt<213>flag标签<400>5asptyrlysaspaspaspasplys15<210>6<211>8<212>prt<213>strep-tagⅱ标签<400>6trpserhisproglnpheglulys15<210>7<211>10<212>prt<213>c-myc标签<400>7gluglnlysleuileserglugluaspleu1510<210>8<211>28<212>dna<213>ttxy43-f引物<400>8cggaattcatggctccattgatcaccaa28<210>9<211>27<212>dna<213>ttxy43-r引物<400>9ggggtaccttactctggcttctcggta27<210>10<211>21<212>dna<213>引物5'aox<400>10gactggttccaattgacaagc21<210>11<211>21<212>dna<213>引物3'aox<400>11gcaaatggcattctgacatcc21<210>12<211>984<212>dna<213>野生型糖苷水解酶编码基因<400>12atggcgcccctcatcaccaacatcttcacggccgacccgtcggcccacgtcttcgagggc60aagctcttcatatacccgtcgcacgatcgcgagacggacatcaagttcaacgacgacggc120gaccagtacgacatggtcgactaccacgtattcagcaccgagtcgctggacccggccgcc180cccgtgaccgaccacggcgtcgtgctccgggccgaagacgtcccctgggtgtccaagcag240ctctgggcccccgacgccgcctacaaggacggcaggtactacctctacttccccgcccgc300gacaagcagggcgtcttccgcatcggcgtcgccgtcggcgaccgccccgagggccccttc360acccccgacccggagcccatccgggacagctacagcatcgacccggccgtcttcgtcgac420gacgacggccgggcctacatgtactttggcgggctctggggcggccagctgcagtgctac480cagaagggcaacggcatcttcgaccccgagtggctggggcccagggagccctcgggcgag540ggcgtccgggcgctggggccgcgcgtcgcccggctggcggacgacatgcgccagttcgcc600agcgaggtgaaggagatttcgatcctggcgcccgagacgggcgagccgatcgcggccgac660gaccacgaccgccgcttcttcgaggccgcctggatgcacaagtacgacggcaagtactac720ttcagctactccaccggcgacacccactacctcgtctacgccgtcggcgacagcccctac780gggcccttcacctacgccggccgcatcctcgagcccgtcctcggctggaccacgcaccac840tccatcgtcgagttccacggccgctggtggctcttccaccacgactgcgagctcagcggc900ggagtcgaccacctgcgctccgtcaaggtcaaggagatcttctacgacaaggacggcaag960attgtcactgaaaagcccgaatag984当前第1页12