用于早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的体外方法与流程

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度的体外方法及预后的体外方法、产品。

背景技术：

脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmalsubarachnoidhaemorrhage，asah)是脑动脉瘤出血导致的颅内蛛网膜下腔出血。临床发病病死率和致残率高达45％，占脑卒中的5％。多数影响预后的原因主要为早期的脑损伤及血管痉挛，以及由此产生的迟发性脑缺血。最近许多研究者发现早期脑损伤是导致asah不良预后的决定性因素，所以针对asah早期病理生理变化的研究尤为重要。早期脑损伤可能和微循环不足、离子稳态的破坏、炎症和微血管收缩有关。一种无创生物标记物的发现可以早期发现病人病情变化及评价可能的预后。

micrornas(micrornanas)是17-24个核酸的非编码rna，通过和mrna结合调控基因的转录后水平。许多研究提示micrornanas参与许多生理和病理过程，同时也作为多种疾病的诊断和治疗手段，包括：卒中、帕金森病、脑外伤和阿尔兹海默症。研究者也提示micrornanas在asah患者的脑脊液中异常表达。并且micrornanas相对于lincrnas和mrnas更加稳定，不易降解，普遍存在于组织、外周血和脑脊液中。

脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血(asah)是一种严重的发病年龄较早的脑卒中，发病后死亡率及致残率都很高。过去认为蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛以及相关的迟发性脑缺血是影响预后的主要原因。但是超过一半的住院病人死于sah最初的48小时内，并且逆转颅内大血管痉挛也无法降低死亡率及促进神经功能恢复。最近的研究提示sah发病早期出现的早期脑损伤(ebi)可能为影响病人预后重要因素，基础研究和临床显示sah后ebi主要因素可能与脑缺血有关，但如何诊断sah患者ebi的严重程度对于sah治疗至关重要，特别是对于甄别未引起患者意识障碍的损伤但至今还没有一种可靠、方便且准确的监测方法，这就使得研发更加准确、灵敏、无创的ebi诊断方法尤为重要，并且可对预后起到很好的预测作用。但现有技术手段只能通过判断患者的意识状况和头颅ct出血量来主观判断。亟待研发一种用于早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度的体外方法及脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血预后。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种用于早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的体外方法，用以解决现有技术只能通过判断患者的意识状况和头颅ct出血量来主观判断病情而导致预测不准确，不能提前预测的缺陷。

为实现上述目的，本发明实施例提供一种用于早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的体外方法，通过测定血浆外泌体的micrornas表达水平。

优选的，所述micrornas为microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p中的一种或几种。

优选的，所述microrna-193b-3p、microrna-486-3p表达量增高与脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重度及预后不良有关。

优选的，所述microrna-369-3p和microrna-410-3p表达降低与脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重度及预后不良有关。

本发明实施例还提供一种早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的产品，所述产品通过测定血浆外泌体的micrornas表达水平确定脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后。

优选的，所述产品为检测芯片或检测试剂盒；

所述芯片包括固相载体上固定有特异性对应于microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p中的至少一种microrna的部分或全部寡核苷酸序列；

所述试剂盒包括用于检测microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p中至少一种microrna的表达水平的试剂。

优选的，所述microrna-193b-3p引物序列如seqidno.1所示；microrna-486-3p引物序列如seqidno.2所示；microrna-369-3p的引物序列如seqidno.2所示；microrna-410-3p的引物序列如seqidno.4所示。

优选的，所述检测试剂盒包括逆转录所用试剂，所述试剂包括总rna为模板、逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rnaase抑制剂、mmlv逆转录酶、ploya加尾酶。

优选的，所述检测试剂盒还包括实时定量pcr所用试剂，所述试剂包括microrna-193b-3p、microrna-486-3p、microrna-369-3p和microrna-410-3p特异性正向pcr引物、外参cel-microrna-39引物、通用反向引物、实时荧光定量sybr染料、无酶水。

本发明实施例中，外泌体为30到100nm的脂质膜囊泡，包含蛋白、脂质、mrna和非编码rna等，可以穿过血脑屏障，也可以进行特异性长距离的细胞间通讯。脑细胞可以释放外泌体穿过血脑屏障进入循环，类似于内皮细胞和外周细胞分泌外泌体进入血液循环。所以外泌体可在外周血中被检测出来。

本发明的mirna主要是指人的mirna也可写成microrna。例如，在发明实施例中，“microrna-193b-3p”也代表“hsa-mir-193b-3p”。

本发明实施例具有如下优点：·

本发明实施例首次运用外泌体micrornana测序、real-timepcr方法和技术，从血液外泌体中筛选出与asah发生发展密切相关的潜在生物标记物micrornana，临床验证其作为asah的特异性、灵敏性及可行性，并探讨其与asah病人预后的相关性，确定了microrna-193b-3p和microrna-486-3p表达增高和预后不良有关，而microrna-369-3p和microrna-410-3p表达降低和预后不良有关，为asah的监测及评价预后提供新的方法，改善该类疾病的诊疗效果提供理论基础和实验依据。

附图说明

图1为本发明实施例的外泌体电镜图；

图2为本发明实施例的标志膜蛋白的表达电泳图，图中分别为cd63蛋白和alix蛋白；

图3为本发明实施例的micrornanas的差异性表达示意图；

图4为本发明实施例的候选micrornanas的表达示意图；

图5为本发明实施例的4种候选micrornanas的roc曲线图；

图6为本发明实施例的四种候选micrornanas和入院严重程度的关系示意图；

图7为本发明实施例的四种候选micrornanas和患者预后的关系示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

本发明实施例提供通过检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血标记物血浆外泌体micrornas及其在评价疾病严重程度及预后的体外检测方法，运用外泌体micrornana测序、real-timepcr方法，从血液外泌体中筛选出与脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血asah发生发展密切相关的潜在生物标记物micrornas，临床验证其作为asah的特异性、灵敏性及可行性，通过对asah的监测疾病的严重程度及预后。

实施例1试验设计及标本采集

1、试验设计

受试者都由自己或者家属签署知情同意书，研究过程采用的所有标本均通过伦理委员会通过，本发明实施例分三个阶段：发现阶段、教练组、验证阶段。对脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmalsubarachnoidhaemorrhage，asah)和对照组血浆外泌体进行二代测序，发现差异性micrornanas。再通过10对血浆的小样本进行教练组的研究，确定进入验证阶段的候选micrornanas。随后对候选micrornanas进行大样本的验证。神经功能预后通过改良rankin评分评价。其中，0-2分为预后良好，3-6分为预后不良。

2、标本采集

所有血标本都是用edta抗凝管采集，并在2小时内进行离心分离血浆。血标本先在4℃下500转离心10分钟去除血细胞，后转移上清到无酶的1.5mlep管，并4℃下300转离心10分钟去除血小板及细胞碎片。转移上清存放于-80℃冰箱。

实施例2外泌体的提取、电镜观察及wb验证

1、外泌体分离

外泌体通过exoeasymaxikit(fromplasma；qiagen,valencia,ca)进行分离。先将标本通过0.8μm过滤管进行过滤。将标本和bufferxbp按1：1进行等体积混合并室温孵育5分钟。再转移到过滤膜的离心管中，500g离心1分钟去除离心液。分离的外泌体应用bufferxwp进行清洗5000g离心5分钟去除杂蛋白。最后，用bufferxe进行溶解收集的外泌体。利用bca法测量浓缩的外泌体的量。透射电子显微镜法，外泌体被碳涂层镍网格进行吸收1小时，后用pbs洗三次，每次5分钟，再用2％甲醛固定十分钟。使用醋酸铀酰和柠檬酸铅负染，用去离子水清洗三次，干燥后80kv透射电子显微镜jeoljem-1400进行观察拍照。

2、蛋白质免疫印迹，先用10％sds-page对外泌体进行跑胶，再进行转膜。4℃下cd63蛋白和alix蛋白一抗进行孵育过夜，再二抗结合后利用ecl对免疫复合物进行显现定量。

3、外泌体特征通过电镜证实外泌体大约在30-100nm之间，如图1所示，并对其标志性膜蛋白进行蛋白质印记检查如图2所示。

实施例3ngs测序、数据收集和差异性micrornas分析

1、ngs测序

小rna文库构建：应用trizol进行总rna的提取。使用bioanalyzer2100对总rna进行定量并检测纯度，rin大于7.0为纯度合格。大约1ug总rna即可建库，应用illuminahiseq2500进行测序。

2、数据收集

原始数据通过acgt101-microrna进行采集，并去除二聚体、rrna、trna、snrna、snorna和重复序列。随后通过blast检索将18～26个核苷酸中的独特序列应用micrornabase21.0，识别已知的micrornanas及新的3p-或5p-micrornanas。

3、差异性micrornanas分析

应用fisher精确检验、x²2*2检验、x²n*n检验、t检验或基于实验设计的方差分析对测序结果进行差异化检验。显著性阈值分别为0.01和0.05。

外泌体microrna表达谱：测序结果显示对人类基因组序列9百万-1千五百万次读取。有>50,000种不同的rna序列。2139种已知micrornas中有746中micrornas被读取。分析asah和对照组，发现他们表达谱的差异。按照矫正p值<0.05，|log2(foldchange)|>1和表达水平不为低的标准，有六种micrornas被认为表达有差异，六种micrornas分别为：hsa-microrna-369-3p,hsa-microrna-136-3p，hsa-microrna-410-3p，hsa-microrna-195-5p，hsa-microrna-486-3p，andhsa-microrna-193b-3p。

上述六种micrornas的序列如下：

实施例4逆转录和rt-pcr

1、逆转录

应用micrornacuteplusmicrornanafirst-strandcdnasynthesiskit(北京天根生物)合成cdna及加尾。2×micrornanartreactionbuffer(10μl),2μlmicrornanartenzymemix,4μltotalrnaand4μlrnase-freeddh2o，一共20μl体积，42℃保持60分钟，95℃保持3分钟，合成的cdna储存在–20℃冰箱备用。

2、realtimepcr

使用micrornacuteplusmicrornanaqpcrdetectionkit(sybrgreen，天根生物)在cfx96touthtmreal-timepcr机(bio-radlab,inc.)进行检测。按照20μl反应体系配置溶液，2μl正向引物：

microrna-193b-3p(seqidno.1)：

5’aactggccctcaaagtcccgct3’；

microrna-486-3p(seqidno.2)：

5’gcggggcagctcagtacaggat3’；

microrna-369-3p(seqidno.3)：

5’accggccgcggaataatacatggttgatctttt3’；

microrna-410-3p(seqidno.4)：

5’ccgcgggaatataacacagatggcctgt3’；

microrna-136-3p(seqidno.5)：

5’ccgcggcatcatcgtctcaaatgagtct3’；

microrna-195-5p(seqidno.6)：

5’cgccggtagcagcacagaaatattggc3’；

10μlmicrornacuteplusmicrornanapremix；0.4μl通用反向引物(seqidno.7：5’caggtccagtttttttttttttttcgt3’)；2μlcdna和5.6μlddh2o。然后按照95℃维持15min,5个循环：25sec维持94℃,30sec维持65℃和34sec维持72℃,然后45个循环：20sec维持94℃,34sec维持60℃。ct值大于30被认为为无效表达，利用2^-△ct进行结果计算。

实施例5

1、统计分析

使用统计学软件medcalcversion15.0.0分析数据。数据取平均值±标准差，应用mann-whitneyu检验或kruskal-wallis检验对两组或多组差异进行比较。两组相关系数应用spearman秩和检验。应用诊断学方法roc曲线可对asah特征进行探讨。先将1年的预后采用单因素分析，后应用p<0.2标准将单因素分析结果进行多因素分析，计算asah预后可能的相关因素，并得出风险因素or及其95％可信区间。p<0.05被认为具有统计学意义。

实施例6mirnas表达和脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血asah严重程度的关系

对表达谱进行验证：先用10例asah患者标本和10例正常对照，对这六种差异性micrornanas进行qrt-pcr试验，其中，如图3所示，hsa-microrna-369-3p,hsa-microrna-410-3p,hsa-microrna-193b-3p,和hsa-microrna-486-3p表达有统计学差异，随后大样本对这四种候选micrornanas进行研究，样本包括113例asah和20例正常对照。相对于对照组，其中，如图4所示，4种micrornanas表达都有差异，并且应用roc曲线研究，如图5所示，发现它们的auc面积分别为：microrna-369-3p:0.994；microrna-410-3p:0.987；microrna-193b-3p：0.999；和microrna-486-3p:0.976。候选micrornanas和患者早期病情严重程度和预后的关系：将wfns分级i-iii化为轻型asah，iv-v为重型asah。结果显示microrna-193b-3p和microrna-486-3p在重型asah中表达增加，而microrna-369-3p和microrna-410-3p在重型asah中表达降低，如图6所示。本发明实施例的4种micrornanas表达和wfns严重程度的相关度分别为：microrna-369-3p(ρ＝-0.660；p<0.001；95％ci:-0.753---0.541),microrna-410-3p(ρ＝-0.626；p<0.001；95％ci:-0.727---0.499),microrna-193b-3p(ρ＝0.774；p<0.001；95％ci:0.688--0.839)和microrna-486-3p(ρ＝0.818；p<0.001；95％ci:0.746--0.871)。根据预后良好标准，分析显示microrna-193b-3p和microrna-486-3p表达增高和asah预后不良有关，而microrna-369-3p和microrna-410-3p表达降低和asah预后不良有关。

实施例7qrt-pcr验证mirnas表达和asah预后的关系

本发明实施例中，早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的试剂盒，包括检测四种mirnas的引物，

mir-193b-3p(seqidno.1)：5’aactggccctcaaagtcccgct3’；mir-486-3p(seqidno.2)：5’gcggggcagctcagtacaggat3’；mir-369-3p(seqidno.3)：5’accggccgcggaataatacatggttgatctttt3’；mir-410-3p(seqidno.4)：5’ccgcgggaatataacacagatggcctgt3’)的qrt-pcr的引物。

从血浆中提取外泌体并提取rna并进行逆转录及qrt-pcr的所有试剂。提取rna的方法同实施例1，包括：从血浆中提取外泌体中rna的所有试剂：外泌体助沉剂，带有膜吸附的试管、rna稳定溶液、trizol试剂、三聚甲醛、异丙醇、无酶水、外参cel-mir-39。逆转录，以总rna为模板将mir-193b-3p、mir-486-3p、mir-369-3p和mir-410-3p逆转录为cdna，逆转录所用试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rnaase抑制剂、mmlv逆转录酶、ploya加尾酶。

进行实时定量pcr，所用试剂包括mir-193b-3p、mir-486-3p、mir-369-3p和mir-410-3p特异性正向pcr引物、外参cel-mir-39引物(seqidno.8：5’cgucaccggguguaaaucagcuug3’)、通用反向引物(seqidno.7：5’caggtccagtttttttttttttttcgt3’)、实时荧光定量sybr染料、无酶水。

通过qrt-pcr对113例asah患者和20例正常对照的血浆进行分析，如图4所示，外泌体mir-193b-3p、mir-486-3p、mir-369-3p和mir-410-3p在两者中表达差异具有统计学意义，并通过logistics回归分析，如图7所示，外泌体mir-193b-3p、mir-486-3p、mir-369-3p和mir-410-3p变化和患者预后密切相关，根据预后良好标准，分析显示microrna-193b-3p和microrna-486-3p表达增高和预后不良有关，而microrna-369-3p和microrna-410-3p表达降低和预后不良有关。

如图4所示，本发明实施例中，40例和20例检测结果的数据统计或图谱分析。

实施例8mirnapcr芯片验证microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p的表达差异

本发明实施例中，mirna提取的方法如同实施例1，micrornacuteplusmicrornanafirst-strandcdnasynthesiskit(北京天根生物)合成cdna及加尾，得到完整的cdna，然后将cdna模板稀释后加入到含有microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p四种特异性引物以及pcr反应液的芯片中，进行实时定量pcr反应。计算ct值，利用2^-△ct进行结果计算。

通过测定microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p可以早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血的严重程度以及预后，即microrna-193b-3p和microrna-486-3p表达增高和预后不良有关，而microrna-369-3p和microrna-410-3p表达降低和预后不良有关。

作为可变化的实施方式，可以选择microrna-193b-3p，microrna-486-3p，microrna-369-3p，microrna-410-3p中的任意一种或几种做成pcr检测试剂盒或芯片进行检测。

本发明实施例的早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的芯片或试剂盒，对脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血asah的病重程度以及预后相关，脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血asah发生发展密切相关的潜在生物标记物，microrna：mir-193b-3p、mir-486-3p、mir-369-3p和mir-410-3p在临床验证其作为asah标记物的特异性、灵敏性及可行性，为asah的监测及评价预后提供新的方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>皖南医学院第一附属医院（皖南医学院戈叽山医院）

<120>用于早期检测脑动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度及预后的体外方法

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