一株乳酸乳球菌ZF625及其应用的制作方法

本发明属于微生物应用和食醋酿造
技术领域：
，具体涉及一株耐乙醇、高产乳酸的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)zf625，还涉及所述乳酸乳球菌在液态发酵食醋中的应用。
背景技术：
：乳酸菌广泛分布于自然界中，具有非常悠久的应用历史，是传统酿造食品如食醋、酱油、泡菜等产品生产中的重要微生物。食醋的酿造方法主要分为两类：一类是传统固态发酵法，如镇江香醋、山西老陈醋等均是固态发酵法酿制而成的，其特点是采用谷物为原料，蒸煮之后分步添加曲料，并经过长时间发酵和陈酿后，最终酿制成食醋产品，在此生产过程中，原料、曲料等能够带入多种乳酸菌，发酵过程中乳酸菌产生的乳酸具有酸味柔和、刺激性小、风味好等特点，同时可以缓和醋酸刺激较强的酸味，使食醋口感变得圆润醇厚，提升食醋感官品质；另一类是液态发酵法，其工艺特点是淀粉质原料经淀粉酶、糖化酶酶解之后，分步添加酵母菌和醋酸菌进行发酵，经过短时间快速发酵获得产品食醋，这种工艺具有周期短、机械化程度高、成本低等多项优势，但也因为使用菌种较为单一，发酵周期短等原因，导致液态发酵食醋存在风味不足、口感较差等问题。目前，用于食醋改善口感、提升风味常见方式是在发酵过程中添加乳酸菌。例如，发明专利cn106119166a公开了一株瑞士乳杆菌及其应用，该发明中从镇江香醋生产工艺过程的酒醪中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造使用的瑞士乳杆菌，将其应用于固态发酵可明显提高食醋中乳酸的含量，改善产品风味，提高产品品质。发明专利cn106190893a公开了一株筛选自镇江香醋醋醅的发酵乳杆菌，并进一步提出了发酵乳杆菌的直投式菌粉及其应用，该菌粉的使用可明显提高固态发酵食醋中乳酸菌的数量，增加不挥发酸的含量，改善产品风味和品质。以上两项发明专利所述菌种都是筛选自镇江香醋发酵工艺，且主要用于传统固态发酵食醋(如镇江香醋、米醋等)风味口感的改善，但是，其对现有液态发酵酿制食醋是否有提升，文中并未提及，此外，液态发酵与固态发酵过程中微生物所处环境差异较大，且液态发酵法酒精发酵过程会使体系中聚集大量的乙醇，乙醇含量达到8％vol，甚至更高，不利于普通乳酸菌的生长，抑制了乳酸菌产乳酸能力。获得适用于液态发酵，且具备耐乙醇、高产乳酸性能的乳酸菌，将有助于提升液态发酵食醋的风味和口感品质。液态发酵法生产食醋因周期短、机械化程度高、成本低等多项优势已在我国被广泛使用，但是，因采用原料酶水解、单一菌种发酵、缩短发酵周期等工艺特点，导致液态发酵法生产的食醋存在风味较差、酸味刺激大、缺乏醇厚感等缺点，同时，普通的乳酸菌在液态发酵高乙醇含量环境中生长缓慢，产酸能力差，很难用于工业化生产。技术实现要素：基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一株耐乙醇、高产乳酸的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)zf625，用于食醋液态发酵，可提升食醋中乳酸含量，解决目前液态发酵食醋风味较差、酸味刺激大、缺乏醇厚感等问题。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一株乳酸乳球菌(lactococcuslactis)zf625，其已于2018年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60522，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明的乳酸乳球菌zf625的菌落形态特征如下：mrs培养基平板上培养48h，菌落呈圆形，凸起，不透明，有光泽，微白色，湿润，边缘整齐，直径1～3.0mm。作为本发明的另一个方面，本发明还提供了上述的乳酸乳球菌zf625在食醋发酵中的用途。作为上述方案的进一步优化，本申请的发明人经多次试验发现，将乳酸乳球菌zf62应用在食醋发酵工艺中，发酵所得食醋中乳酸含量高达1.65g/100ml，并且食醋风味丰富醇和、酸味柔和舒适。作为上述方案的进一步优化，其中食醋为香醋、米醋、白醋、果醋中的任意一种。作为上述方案的进一步优化，其中发酵为液态发酵。作为本发明的又一个方面，本发明所述的乳酸乳球菌zf625的诱变选育方法如下：(1)使用紫外诱变法对出发菌株进行诱变，并涂布于添加有碳酸钙的mrs培养基平板上进行厌氧培养；(2)从步骤(1)培养所得菌落中挑取出钙溶圈直径显著大于出发菌株的菌落进行划线纯化，纯化后挑取单菌落于37℃厌氧培养48h，然后置于4℃冰箱保存；(3)将步骤(2)中保存的菌落分别接种到含有8％～10％vol乙醇的mrs培养基中，35℃～45℃厌氧扩大培养48h，并涂布于mrs培养基平板上进一步筛选出耐乙醇性能良好的菌株；(4)将步骤(3)中筛选所得菌株分别接种到含8％～10％vol乙醇的mrs培养基中，35℃～45℃厌氧培养，并测定培养基中乳酸含量，以筛选获得耐乙醇、高产乳酸的菌株。本发明的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)zf625，是以乳酸乳球菌sf02为出发菌株，通过紫外诱变法诱变获得变异菌株，具体地，本发明的出发菌株乳酸乳球菌sf02购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc20090。作为上述方案的进一步优化，步骤(1)中mrs培养基的配方为：分别称取10g酪蛋白胨，20g葡萄糖，4g酵母粉，4g牛肉浸粉，5g醋酸钠，2g柠檬酸三铵，2g磷酸氢二钾，0.2g硫酸镁，0.05g硫酸锰，1g吐温-80，溶于1000ml蒸馏水，调节ph值为6.2±0.2，分装，0.1mpa，121℃灭菌20分钟。作为上述方案的进一步优化，步骤(1)中添加有碳酸钙的mrs培养基平板的配方为：向所述mrs培养基中分别加入15～20g琼脂粉和10～20g碳酸钙。本发明的有益效果为：本发明通过诱变筛选获得一株耐乙醇、高产乳酸的乳酸乳球菌zf625，可直接添加于采用液态发酵法酿造食醋的工艺中，通过乳酸乳球菌zf625的作用，能够显著提高食醋中的乳酸含量，改善食醋风味和品质，降低食醋酸味刺激性，提升醇厚感。因此，本发明的乳酸乳球菌zf625特别适用于制备食醋。附图说明图1为本发明的实验路线图；图2为本发明乳酸乳球菌zf625菌株的菌落形态图。具体实施方式本发明从乳酸乳球菌sf02(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号:cicc20090)出发，使用紫外诱变法对出发菌株进行诱变获得变异菌株，使用添加碳酸钙的mrs培养基对变异菌株进行筛选；挑选出钙溶圈直径显著大于出发菌株的菌落，将挑选出的菌落划线纯化后作为初筛菌株；然后将初筛菌株接种到含乙醇的mrs培养基中，采用平板计数法筛选出耐乙醇良好的复筛乳酸乳球菌12株，最后将复筛乳酸乳球菌菌株分别接种到8％vol乙醇的mrs培养基中培养，测定培养基中乳酸含量，根据乳酸含量筛选出一株耐乙醇、高产乳酸的乳酸乳球菌zf625。将乳酸乳球菌zf625添加到食醋液态发酵工艺中，发酵结束后，食醋中乳酸含量达到1.65g/100ml，食醋风味丰富醇和、酸味柔和舒适。为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明的实验路线图参见图1。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1菌株诱变与筛选(1)菌株诱变将乳酸乳球菌sf02作为出发菌株，采用mrs培养基进行培养，并在对数生长期取菌液进行紫外诱变，经过紫外诱变后的菌液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将菌液分别稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，制成菌体稀释液。(2)菌株筛选取适当稀释度的菌体稀释液0.2ml涂布于含有碳酸钙的mrs培养基平板上，37℃厌氧培养48小时，挑选出钙溶圈直径显著大于出发菌株的菌落作为初筛菌株，重复划线纯化两次，初步筛选获得26株产酸能力较好的乳酸乳球菌，钙溶圈直径越大说明菌株的产酸能力越好。将初筛菌株接种到8％vol乙醇的mrs培养基中，37℃厌氧培养48小时，然后涂布于mrs培养基平板上进行平板计数，进一步筛选出耐乙醇性能良好的复筛乳酸乳球菌12株，编号为lf620～lf631，最后将复筛乳酸乳球菌接种到8％vol乙醇的mrs培养基中，37℃厌氧培养72小时，测定培养基中乳酸含量。复筛乳酸乳球菌产乳酸检测结果如表1所示。mrs培养基配方为：酪蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉4g，牛肉浸粉4g，醋酸钠5g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801g，蒸馏水1000ml，调节ph6.2±0.2。含碳酸钙的mrs培养基平板配方为：向上述mrs培养基中分别加入15g琼脂粉和20g碳酸钙。表1复筛乳酸乳球菌产乳酸结果乳酸含量g/100mllf6201.38lf6210.42lf6220.33lf6231.56lf6241.44lf6251.82lf6260.97lf6271.13lf6281.56lf6290.33lf6300.95lf6311.36sf020.23根据表1产乳酸含量筛选出一株耐乙醇、高产乳酸的乳酸乳球菌lf625；表1结果显示，与出发菌株sf02相比，通过诱变和筛选获得了具有更强产乳酸能力的诱变菌株，其中lf625产乳酸能力最强，达到1.82g/100ml。本实施例选育获得的lf625已经由本发明人保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为乳酸乳球菌(lactococcuslactis)zf625，保藏号为gdmcc.no：60522。因此，在本申请中，lf625与zf625是指同一菌株。乳酸乳球菌zf625的菌落特征如图2所示：在mrs培养基平板上培养48h，菌落呈圆形，凸起，不透明，有光泽，微白色，湿润，边缘整齐，直径1～3.0mm。实施例2传代稳定性测试将实施例1所得乳酸乳球菌zf625接种至mrs斜面培养基上连续传代10代，传代培养条件为：37℃厌氧培养48小时，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代传代菌株按照实施例1中所述的方法接种至含8％vol乙醇的mrs培养基培养72小时后进行乳酸含量的测定，测定结果如表2所示。表2乳酸乳球菌zf625传代稳定性检测项目第1代第5代第10代乳酸含量g/100ml1.821.801.83表2结果显示，各代菌种接种于含8％vol乙醇的mrs培养基，第1代、5代、10代之间的乳酸含量误差在10％误差范围内，表明乳酸乳球菌zf625产乳酸能力保持稳定，具有良好的传代稳定性，适合工业化应用。实施例3食醋液态发酵(1)种子液制备一级种子液的制备：按照5％体积比的接种量，将实施例1中所获得的乳酸乳球菌zf625接种到mrs培养基中，37℃培养20h。二级种子液的制备：按照5％体积比的接种量，将一级种子液接种到含8％vol乙醇mrs培养基中，37℃培养20h。(2)液态发酵称取10kg大米粉，加入30l水，搅拌后加热煮沸进行高温糊化，然后降温至60～75℃，加入淀粉酶液化15～30min，控制温度在45～60℃，添加糖化酶，搅拌糖化30～45min，结束后通入50l液态发酵罐，控制温度在28～32℃，加入酵母进行酒精发酵，24小时后，按照1％体积比的接种量加入含有乳酸乳球菌zf625的二级种子液，继续发酵48小时。接入醋酸菌，进行醋酸发酵15天。(3)乳酸含量的检测乳酸采用高效液相色谱法测定，参照gb/t18623-2011。将含有乳酸乳球菌zf625的二级种子液接种至液态发酵罐后，分别在0天、2天、5天、15天对发酵液进行乳酸含量的检测，空白对照组为不添加含乳酸乳球菌zf625的二级种子液进行液态发酵，其他条件均相同，结果如表3所示。表3接种乳酸乳球菌后不同时间发酵液中乳酸含量表3结果显示，相比空白对照组，添加乳酸乳球菌zf625的液态发酵食醋中乳酸含量大大提高，由0.03g/100ml提升至1.65g/100ml。(4)食醋感官评价本实验召集10名有丰富经验的鉴评人员对液态发酵所得食醋进行感官鉴评。发酵所得食醋分别采用接种乳酸乳球菌zf625，出发菌株乳酸乳球菌sf02和不接种乳酸乳球菌进行液态发酵，液态发酵食醋方法参见实施例3中步骤(1)和步骤(2)，感官鉴评的评价指标包括风味、口感及酸味，分值为0～10分，分值越高，该项指标越好。表4食醋感官评价结果表4结果显示，乳酸乳球菌zf625应用于液态发酵食醋中，与空白对照组相比，食醋口感风味得到显著改善，感官品质得到明显提升，且与诱变出发菌株乳酸乳球菌sf02的应用效果相比，也有显著提升。乳酸乳球菌zf625应用于液态发酵食醋中，可使食醋风味丰富、口感醇厚、酸味柔和。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12