一种内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料领域，特别涉及一种内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管及其制备方法和应用。

背景技术：

管状生物材料在血管组织工程，人工血管，神经修复，尿道修复，人工食道等领域具有重要的应用。研究证实，管材内表面的形貌特征对其生物相容性具有重要影响，尤其对于与血液直接接触的血管支架和人工血管，管材内腔表面的形貌结构直接影响血液相容性和内皮化结果。在管材内表面构造特殊的纹路结构，可以赋予管材特殊的性能，如促进内皮细胞的粘附、迁移和增殖等。然而对管材内表面纹路的直接塑造往往存在困难，尤其是对在血管组织工程中具有良好应用潜能的细菌纳米纤维素基管材的内表面更加难以进行纹路修饰。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管及其制备方法和应用，管型材料内表面纹路可改善细胞的粘附、迁移和生长，在血管组织工程、神经修复、尿道修复等领域具有良好的应用前景。

本发明提供了一种内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管，将固定在具有纹路的模具上的细菌纳米纤维素基管进行碱缩和洗涤而得。

所述纹路为横纹、竖纹、螺旋纹或交叉纹，但并不限于上述纹路。具有纹路的内表面可提高细胞的粘附、迁移和生长，甚至引导细胞的铺展，可根据应用不同设计不同种类的纹路，在血管组织工程、神经修复、尿道修复等领域具有良好的应用前景。譬如定向排列纹路为细胞提供有效的生物地形指引，细胞可以识别“地形”的指引，并生长成有组织的形态，而随机无序的纹路使细胞形态呈无规则状态。冠状动脉平滑肌细胞就可沿着竖纹定向支架轴向粘附、生长并呈梭形。所述模具为管状或柱状模具，其材料为玻璃、金属、陶瓷或聚合物。模具的纹路图案和尺寸对应着内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管。

所述细菌纳米纤维素基管为由细菌纳米纤维素膜或其复合膜卷曲形成的多层管或者原位培养形成的细菌纳米纤维素管或其复合管。

所述多层管具有形状记忆功能，可在外力作用下平铺为膜，在外力去除后可自动卷曲，恢复管状。管的力学性质可以通过对卷起的层数以及各层的厚度和性质控制而调整。管壁具有分层结构。

所述原位培养是指通过静态培养或者转鼓动态培育等方法制备的具有纳米纤维网络结构的细菌纳米纤维素管或其复合管。

本发明还提供了一种内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管的制备方法，包括：

将细菌纳米纤维素基管固定在具有纹路的模具上，随后浸没在浓碱溶液中震荡处理，洗涤去除浓碱，移除模具，固定纹路，赋予管材纹路形貌和性能，得到内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管。

所述浓碱溶液为浓度10％-30％的氢氧化钠溶液，震荡处理时间为10min-120min，温度0-50℃。使纳米纤维素基管在具有特殊纹路的模具上发生收缩，形成纹路印花。

所述的氢氧化钠溶液为经脱氧处理的超纯水配制氢氧化钠溶液，操作过程应尽量隔绝氧。

所述洗涤去除浓碱采用纯水或稀酸中和后洗涤。

所述稀酸为硫酸、盐酸、磷酸、柠檬酸或醋酸，浓度为0.1％-5％。

制备的内表面纹路修饰的纳米纤维素基管的机械力学性质可以通过脱水和碱缩工艺(譬如碱浓、碱处理时间、碱处理温度)进行调整。反应温度为30℃左右时，是最佳碱缩温度，达到相似的碱缩效果需要的时间最短。温度提高，反而碱缩速度慢。当碱缩温度恒定时，处理时长越长，碱缩越明显，碱缩30min之后纳米纤维素基管材的体积和形态无明显变化。反应时间固定为60min时，碱缩温度在0℃(冰水混合物)、30℃和50℃中，30℃的碱缩效果最为明显。

本发明还提供了一种内表面纹路修饰的细菌纳米纤维素基管的应用，应用于血管组织工程支架、神经修复支架、人工血管或尿道修复。

本发明制备的内表面纹路修饰的纳米纤维素基管的结晶度较处理前的结晶度有明显的降低，并且重新形成了热力学更稳定的ii型纤维素结晶。结晶度的降低使纤维素中更多的羟基官能团暴露，这些极性官能团可以与一些生物活性分子结合，为制备具有生物活性的复合管提供了化学接枝的新位点。

有益效果

本发明的细菌纳米纤维素基管机械力学性能可控，且具有形状记忆功能，可赋予抑菌活性等；管型材料内表面纹路可改善细胞的粘附、迁移和生长，在血管组织工程、神经修复、尿道修复等领域具有潜在的应用价值；本发明的制备方法不仅可以用于调控以往无法改变的天然细菌纤维素的网络结构，从而调控细菌纤维素的机械性能，而且可以用于快速简便地制备复合材料。

附图说明

图1为实施例1的制备工艺示意图；

图2为实施例1中的纹路修饰的bnc管内表面的螺旋纹形貌；

图3为实施例1中的纹路修饰的bnc管的机械力学性能；

图4为实施例1中的未经纹路修饰的bnc管(a)和经纹路修饰的bnc管(b)上的猪髋内皮细胞活死细胞荧光染色对比；

图5为实施例3中的表面纵纹结构的聚四氟乙烯管状模具示意图；

图6为实施例3中的纹路修饰的bnc/壳聚糖复合管内表面形貌；

图7为实施例3中的未经纹路修饰的壳聚糖/bnc复合管(a)和经纹路修饰的壳聚糖/bnc复合管(b)上的猪髋内皮细胞活死细胞荧光染色对比；

图8为实施例3中的纹路修饰的bnc/壳聚糖复合管的抑菌性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)bnc膜的脱水处理

将厚度为2-3mm、边长为5cm、纤维素含量为0.3％、持水量为99.7％的正方形bnc膜平铺于滤纸上，吸出纤维素膜内约80％的水分，沿一直径为3mm，并且表面具有螺旋纹的不锈钢棒卷起来，形成长5cm的bnc多层管(图1)，用绳子固定。

(2)浓碱溶液的配制

将超纯水煮沸10分钟后密闭冷却，以减少水中溶氧，并用其配制浓度为20％(w/v)的氢氧化钠溶液，密闭，室温放置备用。

(3)bnc多层管的纹路修饰

将步骤(1)中制备的长5cm的bnc多层管置于步骤(2)所述的氢氧化钠溶液中，密闭隔绝空气，置于100rpm的恒温震荡器上，0-50℃下摇动处理20min后去除，用大量超纯水冲洗，去除氢氧化钠。在外力作用下将不锈钢棒上的bnc平铺开后，取出不锈钢棒后去除外力，膜自动卷起形成内表面螺纹结构修饰的bnc管。

实验发现：反应温度为30℃左右时，是最佳碱缩温度，达到相似的碱缩效果需要的时间最短。温度提高，反而碱缩速度慢。当碱缩温度恒定时，在30min内处理时长越长，碱缩越明显，但是碱缩30min之后纳米纤维素基管材的体积和形态无明显变化。反应时间固定为60min时，碱缩温度在0℃(冰水混合物)、30℃和50℃中，30℃的碱缩效果最为明显。

(4)特征及潜在应用

纹路修饰的bnc管内表面具有螺旋状纹路结构(如图2)，同时具有形状记忆功能，可以在外力作用下铺展成膜，外力去除后重新卷缩，恢复管状。这种管材机械力学性能优良并且可以通过控制bnc的层数来控制机械性能。

通过一层bnc卷曲和三层bnc卷曲后形成的bnc管的拉伸测试如图3所示，结果显示，三层bnc卷曲形成的bnc管的拉伸强度达到14n，而一层bnc卷曲形成的bnc管的拉伸强度不到5n。而且，从拉伸曲线可以看出，三层bnc卷曲形成的bnc管的杨氏模量也明显高于一层bnc形成的bnc管。管材平铺后可在不同位置种植不同类型的细胞，而后依靠其形状记忆功能自动卷曲成管，譬如可以模拟血管组织的三层结构，分别在不同位置种植内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，细胞增殖成形后就形成了三层结构的组织血管，因此在组织工程血管中具有很好的应用前景。

将相同数量的猪髋内皮细胞种植在原始的bnc膜表面和种植在本实施例中经过纹路修饰后在外力作用下铺展开的膜的表面，5天后，活死细胞染色结果如图4所示，纹路修饰后的bnc膜表面的内皮细胞明显多于原始的bnc膜表面的细胞。相比于未纹路修饰的bnc膜，纹路修饰后表面更加粗糙，促进了细胞的粘附和生长。

实施例2

(1)细菌纳米纤维素管的制备

静态培育法制备内径为3mm、外径8mm、长10cm的bnc管，经过1％的naoh碱液，80℃碱煮4小时后，用超纯水反复置换，直到中性，得到纯化的bnc管。

(2)浓碱液的配制

配制浓度为10-30％(w/v)的氢氧化钠溶液，密闭，室温放置备用。

(3)bnc管的纹路修饰

将步骤(1)得到的bnc管套在直径为3mm具有花纹的玻璃棒上，置于步骤(2)所配置的naoh溶液中，室温震荡15min后，取下玻璃棒，用超纯水或者醋酸水溶液反复清洗，直至中性，得到内表面具有花纹的bnc管。

此种方法得到的bnc管内表面具有花纹，而且含水率降低，管壁厚度降低，杨氏模量增加。

实施例3

(1)bnc/壳聚糖(bnc/ch)复合管的制备

将通过静态培育法制备的内径为3mm，长5cm，壁厚2.5mm，纤维素含量为0.3％，持水量为99.7％的细菌纳米纤维素管浸泡在壳聚糖浓度为1％，乙酸浓度为1％的超纯水溶液中，室温震荡(100rpm)24h后取出，置于浓度为0.1m的氢氧化钠溶液中，静置24h，使壳聚糖沉积在细菌纳米纤维素管的纤维网路中；

(2)浓碱液的配制

将超纯水煮沸10分钟后密闭冷却，以减少水中溶氧，并用其配制浓度为20％(w/v)的氢氧化钠溶液，密闭，室温放置备用；

(3)bnc/ch复合管的纹路修饰

由于bnc管碱处理之后，内壁贴附在模具的纹路上，不便于取下，所以本实施例中自组装了一种模具，用于bnc管及其复合内表面纹路修饰，如图5所示，模具由两部分组成：外表面光滑的棒状支撑物和两个带有竖纹的半环(半环可以换成其他纹路)，两个半环之间留有空隙，碱处理完成之后，先取下模具内部的棒状支撑物，两个半环向空隙靠近，形成一个外径减小的空心圆柱，使外表面的bnc管的内壁与模具外壁分离，取下具有内表面纹路修饰的bnc复合管。具体过程为将步骤(1)制备的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管套装在一内径为2.5mm，具有纵向突起平行纹路的聚四氟乙烯管状模具上(图5)，复合管的两端用棉线捆扎固定后置于步骤(2)所述的氢氧化钠溶液中，密封，室温23℃震荡处理30min后取出，用浓度为0.5％的盐酸或者硫酸水溶液，或者0.1％-5％的磷酸、柠檬酸或冰醋酸水溶液，冲洗去除氢氧化钠，最后用超纯水冲洗去除盐酸，最终获得长度为5cm，内表面具有平行纵向纹路的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管。

(4)特征及潜在应用

复合管材内表面具有平行状纹路结构(图6)，这种表面纹路修饰在改善血管内皮细胞粘附(图7)的同时不会增大对血液流动的阻力。复合管的机械力学性质可以通过控制壳聚糖复合量和碱缩时间调整。另外，这种复合管具有很好的抑菌效果(图8)，在小口径人工血管中具有潜在的应用价值。