一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术：

母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(humanmilkoligosacchrides,hmos)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(foss)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸盐藻糖(gdp-l-fucose)作为岩藻糖基的供体。再经过岩藻糖基转移酶的催化，将岩藻糖作为活化基团转移到乳糖上，岩藻糖通过α-1,2糖苷键与半乳糖相连，形成2'-岩藻糖基乳糖。

随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的gdp-l-fucose。在化学合成中，gdp-l-fucose以l-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料，由hbr、ag2co3、n-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。gdp-l-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成gdp-l-岩藻糖。在生物中发现了两种合成gdp-l-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径。两种途径都需要乳糖作为底物，但是枯草芽孢杆菌对乳糖的利用能力有限。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成2'-岩藻糖基乳糖，仍是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成2'-岩藻糖基乳糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因是不表达的，通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中插入外源乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'-岩藻糖基乳糖的合成。其中，将p43表达的大肠杆菌乳糖运输酶基因lacy重组在枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶amye位点，来在枯草芽孢杆菌168的基因组中插入外源乳糖运输酶基因。强启动子p43在枯草芽孢杆菌168中过表达了外源乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度。

进一步的，将p43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amye位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。所述乳糖运输酶基因如ncbi中geneid:949083所示。

进一步的，岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌。所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为脆弱拟杆菌9343的fkp基因。所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如ncbi上genbank:ay849806.1所示，所述所述岩藻糖基转移酶为幽门螺旋杆菌futc基因，幽门螺旋杆菌futc基因如ncbi上genbank:ky499613所示。

第二方面，本发明还提供了一种所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)构建包含淀粉酶基因amye位点的上下游序列、乳糖运输酶基因、p43启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认乳糖运输酶基因强化表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌；

(2)构建包含岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌，通过验证，确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌。

进一步的，步骤(1)中，替换框的序列如seqidno.1所示。

进一步的，步骤(1)中，将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框的添加量为100-300ng。

进一步的，步骤(2)中，将脆弱拟杆菌中的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因序列，幽门螺旋杆菌中的岩藻糖基转移酶基因序列和质粒pp43nmk进行克隆连接。

第三方面，本发明还提供了所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成2'-岩藻糖基乳糖。

本发明的有益效果为：

本发明的重组枯草芽孢杆菌，是在重组枯草芽孢杆菌168的基础上在基因组上整合外源乳糖运输酶基因，并在此基础上表达岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的，通过改造获得了可高效合成2'-岩藻糖基乳糖的菌株，其发酵上清液中积累量高达1.042g/l。本发明通过在基因组上强化表达乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'-岩藻糖基乳糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3得到的2'-岩藻糖基乳糖的气质联用色谱图；

图2为本发明得到的lacy转化框pcr验证琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明得到的表达fkp和futc的质粒转化pcr验证琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。

实施例1

引入并强化表达乳糖运输酶基因lacy

根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，atccno.27370)的α-淀粉酶基因amye的上下游序列、乳糖运输酶基因lacy、p43启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如seqidno.1所示的替换框。

将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为25μg/ml博来霉素抗性的lb平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

由于替换框中存在α-淀粉酶基因amye的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amye的上下游序列同源，通过同源重组，替换框中的p43启动子、乳糖运输基因lacy和博来霉素抗性基因替换枯草芽孢杆菌168α-淀粉酶基因amye位点。

通过博来霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，测序后确认乳糖运输酶基因(lacy)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，琼脂糖凝胶电泳图见图2，菌落pcr验证有特殊条带，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即乳糖运输酶基因(lacy)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。

确认乳糖运输酶基因(lacy)强化表达成功后，得到枯草芽孢杆菌168l。

实施例2

外源表达脆弱拟杆菌和幽门螺旋杆菌外源基因

根据ncbi上公布的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis，atccno.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，和幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori，atccno.26695)的岩藻糖基转移酶futc基因序列，通过基因futc,fkp和质粒pp43nmk的pcr线性扩增以及使用clonexpressiionestepcloningkit(vazyme)一步克隆连接，构建序列如seqidno.2所示的重组质粒pp43-fkp-futc。

使用kpni和psti内切酶双酶切fkp、futc基因序列和质粒pp43-mpd，使用50μl体系在37℃反应30min，纯化回收后使用连接酶进行连接，使用10μl反应体系在16℃反应2h。构建序列如seqidno.2所示的重组质粒pp43-fkp-futc。

将构建好的重组质粒电转化枯草芽孢杆菌168l的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，测序后确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，琼脂糖凝胶电泳图见图3，菌落pcr验证有特殊条带，且测序结果与理论结果一致的为转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。

确认脆弱拟杆菌的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到枯草芽孢杆菌168l-ff。

实施例3

发酵生产2'-岩藻糖基乳糖

将上述枯草芽孢杆菌168l-ff制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。

将种子液以od值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/l、蛋白胨6g/l、酵母粉12g/l、(nh4)so46g/l,k2hpo4·3h2o12.5g/l、kh2po42.5g/l、caco35g/l、微量元素溶液10ml/l；微量元素溶液含有：mnso4·5h2o1.0g/l、cocl2·6h2o0.4g/l、namoo4·2h2o0.2g/l、znso4·7h2o0.2g/l、alcl3·6h2o0.1g/l、cucl2·h2o0.1g/l、h3bo40.05g/l、5mhcl，于35℃、200rpm条件下培养20h。

发酵结束时，使用液-质联用色谱仪测定发酵上清液中的2'-岩藻糖基乳糖的含量，2'-岩藻糖基乳糖的气质联用色谱图如图1所示，测定的2'-岩藻糖基乳糖的含量达到1.042g/l。

实施例4

发酵生产2'-岩藻糖基乳糖

将上述枯草芽孢杆菌168l-ff制成种子液，种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。

将种子液以od值为0.3的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/l、蛋白胨6g/l、酵母粉12g/l、(nh4)so46g/l,k2hpo4·3h2o12.5g/l、kh2po42.5g/l、caco35g/l、微量元素溶液10ml/l；微量元素溶液含有：mnso4·5h2o1.0g/l、cocl2·6h2o0.4g/l、namoo4·2h2o0.2g/l、znso4·7h2o0.2g/l、alcl3·6h2o0.1g/l、cucl2·h2o0.1g/l、h3bo40.05g/l、5mhcl，于40℃、250rpm条件下培养25h。

发酵结束时，发酵上清液中2'-岩藻糖基乳糖含量达到0.827g/l。

对比例1

根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，atccno.27370)的α-淀粉酶基因amye的上下游序列、乳糖运输酶基因lacy、p43启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如seqidno.1所示的替换框。

将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为25μg/ml博来霉素抗性的lb平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

由于替换框中存在α-淀粉酶基因amye的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源，通过同源重组，替换框中的p43启动子和乳糖运输基因lacy替换枯草芽孢杆菌168α-淀粉酶基因amye位点。

通过博来霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，测序后确认乳糖运输酶基因(lacy)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落pcr验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即乳糖运输酶基因(lacy)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。

确认乳糖运输酶基因(lacy)强化表达成功后，得到枯草芽孢杆菌168l。

用枯草芽孢杆菌168l发酵生产2'-岩藻糖基乳糖，发酵条件与实施例3相同，发酵结束时，离心收集获得细胞，发酵上清液中未检测到2'-岩藻糖基乳糖。

对比例2

根据ncbi上公布的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis，atccno.25285)岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori，atccno.26695)的岩藻糖基转移酶futc的序列、构建序列如seqidno.2所示的重组质粒。

将构建好的重组质粒电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证，测序后确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落pcr验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。

确认脆弱拟杆菌的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到枯草芽孢杆菌168-ff。

用重组枯草芽孢杆菌168-ff发酵生产2'-岩藻糖基乳糖，发酵条件与实施例3相同，发酵结束时，发酵上清液中2'-岩藻糖基乳糖含量达到0.424g/l。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>光明乳业股份有限公司

<120>一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4681

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>1

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