泊马度胺前体药物盐的多晶型物的制作方法

本发明涉及医药领域，尤其涉及l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐的多晶型物和包含上述多晶型物的药物组合物，及其在制备治疗癌症的药物中的应用。

背景技术：

泊马度胺由美国赛尔基因公司研发，并于2013年2月首次在美国获准上市。泊马度胺是继沙利度胺，来那度胺后第三个上市的同类免疫调节剂，能够增强t细胞和自然杀伤细胞介导的免疫反应，同时抑制单核细胞产生促炎性细胞因子(如tnf-α、il-6等)。此外，泊马度胺能够抑制肿瘤细胞增生并诱导细胞凋亡，对来那度胺耐药的多发性骨髓瘤细胞株亦具有较强的增殖抑制作用。泊马度胺常见的不良反应有中性粒细胞减少，疲乏虚弱，贫血，便秘，腹泻，血小板减少，上呼吸道感染，背痛发热，还可能引起血栓，且可能导致胎儿出现严重的出生缺陷。根据文献报道，泊马度胺属于难溶性药物，测定其在纯化水，ph6.8磷酸盐缓冲液，ph4.5醋酸盐缓冲液和0.1mol/l盐酸中的溶解度，结果分别是17.8，17.0，18.7和18.9μg/ml。泊马度胺的低溶解度不仅增加了制剂工艺的难度，也限制了活性成分在胃肠道的溶出和吸收过程，进而影响口服生物利用度。

pct申请pct/cn2017/098281提供的l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯是一种泊马度胺前体药物，该化合物的结构如下结构式(ⅰ-1)所示：

式(ⅰ-1)结构是一种具有良好溶解度，且显著改善生物利用度的泊马度胺前体药物，在体内能快速代谢成泊马度胺发挥药效。但研究发现该结构稳定性较差，室温放置容易降解。而式(ⅰ-1)结构的双对甲苯磺酸盐，即l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐具有改善的稳定性。

药用化合物存在多晶型现象，晶型的变化通常导致活性成分具有不同的熔点、溶解度、吸湿性、稳定性、生物活性等，这些均是影响药物制备的难易、储存稳定性、制剂难易和生物利用度等的重要因素。由于特定多晶型物具有特异性的热力学性质和稳定性，因此在制备的过程中，了解在各个剂型中应用的化合物的晶型是重要的，以保证生产过程应用相同形态的药物。因此，保证活性成分是单一的晶型或是一些晶型的已知混合物是必要的。

药用化合物的新的多晶型物的发现提供了改善药物物理特性的机会，即扩展了物质的全部性质，从而可以更好地指导活性成分及其制剂的研究，因此本发明提供的l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯盐的多晶型物在药物的制造及其它应用中有商业价值。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双甲苯磺酸盐的多晶型物。

在本发明的第一方面，提供了l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双甲苯磺酸盐(式ⅰ)的多晶型物。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型a，其中，该晶型a具有如下性质：

其使用cu-ka辐射，以度2θ表示的x-射线粉末衍射光谱在3.9±0.2，7.1±0.2，13.1±0.2，13.6±0.2，14.4±0.2，20.6±0.2处有峰。

在一更优选例中，所述晶型a还具有一个或多个选自下组的以度2θ表示的x-射线粉末衍射特征峰：12.3±0.2，19.1±0.2，26.1±0.2，27.7±0.2。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型a，其中，该晶型a具有如下性质：

其使用cu-ka辐射，以度2θ表示的x-射线粉末衍射光谱在3.9±0.2，7.1±0.2，12.3±0.2，13.1±0.2，13.6±0.2，14.4±0.2，19.1±0.2，20.6±0.2处有峰。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型a，其中所述晶型a具有基本如图1所示的粉末x射线衍射图谱。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型a，在加热速度为10℃/分的条件下，其中所述晶型a的差示热量扫描在183.57±2℃有最大吸热峰峰值。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型a，在加热速度为10℃/分的条件下，其中所述晶型a具有基本如图2所示的差热分析吸热曲线图。

再一方面，本发明提供了一种晶型a的制备方法，包括a)将无定形的双对甲苯磺酸盐用丙酮溶解；b)从丙酮中分离出晶型a。

其中步骤a)中丙酮的量以能完全溶解双对甲苯磺酸盐为宜。视需要，可进行搅拌析晶或静置析晶。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型b，其中，该晶型b具有如下性质：

其使用cu-ka辐射，以度2θ表示的x-射线粉末衍射光谱在4.0±0.2，8.9±0.2，11.9±0.2，14.6±0.2，19.3±0.2，20.8±0.2处有峰。

在一更优选例中，所述晶型b还具有一个或多个选自下组的以度2θ表示的x-射线粉末衍射特征峰：7.2±0.2，12.3±0.2，13.2±0.2，23.3±0.2，27.3±0.2。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型b，其中，该晶型b具有如下性质：

其使用cu-ka辐射，以度2θ表示的x-射线粉末衍射光谱在4.0±0.2，7.2±0.2，8.9±0.2，11.9±0.2，13.2±0.2，14.6±0.2，19.3±0.2，20.8±0.2处有峰。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型b，其中，该晶型b具有如下性质：

其使用cu-ka辐射，以度2θ表示的x-射线粉末衍射光谱在4.0±0.2，7.2±0.2，8.9±0.2，11.9±0.2，12.3±0.2，13.2±0.2，14.6±0.2，19.3±0.2，20.8±0.2，23.3±0.2，27.3±0.2处有峰。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型b，其中所述晶型b具有基本如图3所示的粉末x射线衍射图谱。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型b，在加热速度为10℃/分的条件下，其中所述晶型b的差示热量扫描在177.99±2℃有最大吸热峰峰值。

在另一优选例中，所述多晶型物为晶型b，在加热速度为10℃/分的条件下，其中所述晶型b具有基本如图4所示的差热分析吸热曲线图。

再一方面，本发明提供了一种晶型b的制备方法，包括a)将无定形的双对甲苯磺酸盐用1,4-二氧六环溶解；b)从1,4-二氧六环中分离出晶型b。

其中步骤a)中1,4-二氧六环的量以能完全溶解双对甲苯磺酸盐为宜。视需要，可进行搅拌析晶或静置析晶。

在本发明的第二方面，提供了本发明多晶型物的用途，用于制备治疗癌症的药物中的应用。

在另一优选例中，所述的多晶型物用于制备治疗多发性骨髓瘤，前列腺癌的药物。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，其含有l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐的多晶型物和药用载体。

在另一优选例中，药物组合物含有l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐的晶型a和药用载体。

在另一优选例中，药物组合物含有l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐的晶型b和药用载体。

在本发明的第四方面，提供了药物组合物用于制备治疗癌症的药物中的应用。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗多发性骨髓瘤，前列腺癌的药物。

在本发明的第五方面，提供了一种结晶组合物，其中l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐晶型a的结晶组合物是指，组合物中晶型a占组合物重量的50％以上，优选在80％以上，更优选在90％以上，最优选在95％以上，该结晶组合物可以含有少量l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐的其他结晶或无定形形式，包括但不限于晶型b或无定形物；其中l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐晶型b的结晶组合物是指，组合物中晶型b占组合物重量的50％以上，优选在80％以上，更优选在90％以上，最优选在95％以上，该结晶组合物可以含有少量l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯双对甲苯磺酸盐的其他结晶或无定形形式，包括但不限于晶型a或无定形物。

在本发明的第六方面，提供了结晶组合物用于制备治疗癌症的药物中的应用。

在另一优选例中，所述的解决组合物用于制备治疗多发性骨髓瘤，前列腺癌的药物。

本发明的多晶型物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分中的至少一种混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明的多晶型物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明的多晶型物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的多晶型物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～200mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

除非有相反的陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

本发明描述的化合物包括两个不对称中心，且因此可以存在多种异构体形式，例如，对映异构体和/或非对映异构体形式。例如，本发明描述的化合物可为单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体，或者可为立体异构体的混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括：手性高压液相色谱法(hplc)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。本发明另外包括作为基本上不含其它异构体的单独异构体、或者作为多种异构体的混合物的本文描述的化合物。

本发明所述基团和化合物中所涉及的碳、氢、氧、硫、氮或卤素均包括它们的同位素，及本发明所述基团和化合物中所涉及的碳、氢、氧、硫、氮或卤素，任选地进一步被一个或多个它们对应的同位素所替代，其中碳的同位素包括¹²c、¹³c和¹⁴c，氢的同位素包括氕(h)、氘(d，又称为重氢)、氚(t，又称为超重氢)，氧的同位素包括¹⁶o、¹⁷o和¹⁸o，硫的同位素包括³²s、³³s、³⁴s和³⁶s，氮的同位素包括¹⁴n和¹⁵n，氟的同位素包括¹⁹f，氯的同位素包括³⁵cl和³⁷cl，溴的同位素包括⁷⁹br和⁸¹br。

本发明中“具有基本如图1所示的粉末x射线衍射图谱”是指粉末x-射线衍射光谱中至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少99％的峰出现在所给出的粉末x射线衍射图谱中。

需要说明的是，在xrd中，由结晶化合物得到的衍射谱图对于特定的晶型往往是特征性的，其中谱带(尤其是在低角度)的相对强度可能会因为结晶条件、粒径和其它测定条件的差异而产生的优势取向效果而变化。因此，衍射峰的相对强度对所针对的晶型并非是特征性的，判断是否与已知的晶型相同时，更应该注意的是峰的相对位置而不是它们的相对强度。对于同种化合物的同种晶型，其xrd谱图在整体上具有相似性，表征峰位置的2θ角误差一般在±2％之内，例如由于分析样品时温度的变化、样品移动或仪器的标定等，峰的位置可能移动；相对强度误差可较大，但变化趋势一致。还应指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线的缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，甚至几条谱带也可能对给定的结晶是特征性的。

同样需要说明的是，差示热量扫描分析中的吸收峰是本发明晶型具有的固有物性，但在实际的测定中，除了测定误差外，有时会由于混入可容许的量的杂质等原因导致熔点发生变动，这种可能性也是不能否定的。因此，本领域技术人员能够充分理解本发明中的吸热峰温度的实测值可以以何种程度发生变动，举例来说，可以设想的误差是，某些情况下为±5℃左右，优选地为±3℃左右，更优选地为±2℃左右，最优选地为±1℃左右。

本发明使用的分析方法：

1)x射线粉末衍射

测定晶型的x射线粉末衍射的方法在本领域中是已知的。例如使用brukerd8advance衍射仪，采用cu-ka填充管(40kv,40ma)作为具有广角测角仪的x射线源，以2.4°/分的扫描色的，获取图谱。

2)差示扫描量热法

dsc测定方法在本领域中是已知的。例如使用mettlerdsc3+完成差热分析。以10℃/分的升温速率，从25℃升温至250℃，获取晶型的dsc扫描图谱。

附图说明

图1晶型a的粉末x-射线粉末衍射光谱

图2晶型a的差热分析图谱

图3晶型b的粉末x-射线粉末衍射光谱

图4晶型b的差热分析图谱

图5显示了给药后犬血浆中药物浓度和时间的关系

具体实施方式

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所用原料若非特别说明，均市售可得。

实施例1l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯的制备(compound1)的制备

step1：氮气保护下，向1000ml三颈反应瓶中加入s.m.b(20g，73.2mmol，1.00eq)和dmf(400ml)，电磁搅拌。随后缓慢加入氢化钠(3.5g，87.5mmol，1.2eq)，继续搅拌30min后，加入碘化钾(12g，72.2mmol，0.99eq)和tbab(四丁基溴化铵)(3.52g，10.9mmol，0.15eq)，搅拌15min后，将s.m.1(23.8g，72.8mmol，0.99eq)加入，搅拌12h。停止反应，将反应体系倒入2l水中，搅拌1h，有固体析出，过滤，得到黄色固体滤饼，滤饼以500mldcm(二氯甲烷)洗涤，分液，取有机相减压浓缩，柱层析(pe:ea＝1.5：1)，得13.20g黄色固体产品，收率35.8％.

step2：氮气保护下，向100ml三颈反应瓶中加入int1-01(500mg，1mmol，1.00eq)，dcm5ml，室温搅拌10min后，一次性加入hcl/ea(10ml，10mmol，10.0eq)，继续搅拌40min。停止反应，过滤干燥得380mg黄色固体产物，收率86.9％

hplc:97.05％

lcms:403.2(m+h-hcl)

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.56-8.51(d,3h),7.51-7.47(dd,1h),7.06–7.04(d,1h),7.01-7.02(d,1h),6.56(bs,2h),5.91-5.85(dd,1h),5.74-5.69(t,1h),5.28-5.23(m,1h),3.92(s,1h),2.25(m,1h),2.88-2.84(d,1h),2.61-2.51(m,1h),2.16-2.10(m,2h),0.96-0.92(m,6h).

step3：200ml三口瓶中，加入4gl-缬氨酸(3-(4-(氨基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯盐酸盐(int1-02)，40ml乙酸乙酯，冰水浴条件下搅拌5min，然后倒入30ml冰水，继续加入30ml饱和碳酸氢钠，搅拌5-10min，水相再用乙酸乙酯(40ml)萃取一次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯3g备用。

实施例2多晶型物的制备

将1.0g的l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯溶解于50ml乙酸乙酯中，滴加对甲苯磺酸一水合物的乙酸乙酯溶液(1.03g/50ml)，约15分钟滴加完毕。室温搅拌过夜。过滤，滤饼真空干燥。得到双对甲苯磺酸盐1.0g。经图谱分析确认l-缬氨酸(3-(4-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲酯与对甲苯磺酸的摩尔比例为1：2。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.33(brs,3h),7.70–7.43(m,5h),7.17(d,j＝7.8hz,4h),7.05(m,2h),6.42–5.83(m,4h),5.76–5.66(m,1h),5.25(m,1h),3.97(d,j＝3.4hz,1h),3.21–2.96(m,1h),2.86(d,j＝17.5hz,1h),2.70–2.53(m,1h),2.30(s,6h),2.13(m,2h),1.06–0.74(m,6h).

2.1晶型a的制备方法和固态表征：

取上述制备获得的双盐49.1mg，加入到反应瓶中，再加入丙酮2-丁酮0.8ml，反应体系再室温下搅拌72h。离心，弃去上清液，固体40度下真空干燥，得产品35mg(收率71％)。

利用x-射线粉末衍射和差示扫描量热法对晶型a进行了固态表征，其固态表征参数及图谱如本文中所述。

2.2晶型b的制备方法和固态表征：

取上述制备获得的双盐49.1mg，加入到反应瓶中，再加入1,4-二氧六环1ml，反应体系再室温下搅拌72h。离心，弃去上清液，固体40度下真空干燥，得产品10mg(收率20％)。

利用x-射线粉末衍射和差示扫描量热法对晶型b进行了固态表征，其固态表征参数及图谱如本文中所述。

实施例3多晶型物的稳定性

在40℃和60℃的试验条件下，取适量晶型a储存1-10天，结果表明：晶型a十分稳定；且相比较新制备的(0天)晶型a而言，纯度基本没有变化，始终在98％以上。

因此，本发明所述的多晶型物非常稳定，适合用于药物组合物。而且本发明的多晶型物在分装等药品制造过程中，不易扬起，易收集，不易造成浪费，有助于保护操作人员的身体健康。特别需要注意的是，本发明的晶型a制备过程中使用的试剂环保，无毒性，且容易获得，制备收率高。

实施例4犬的药动学数据

本实施例中所使用的为雄性比格犬，体重8.6-10.6kg，购自北京玛斯生物技术有限公司，试验动物皆大于1岁，动物距离上次试验至少有两周以上的间隔。

三只犬采用交叉的设计，清洗间隔至少三天以上，轮流给药nora0310a4(双对甲苯磺酸盐)10mg口服胶囊(相当于3.7mg的泊马度胺)和nora0312(泊马度胺)4mg口服胶囊(pomalid,由natcopharmalimited生产)。各周期以口服投药的方式给予一颗胶囊，配合50ml的水协助吞咽。

试验方法：给药前，给药后0.5、1、2、4、6、8、10、24和48小时采集血样，采入含有edta-2k的抗凝管中的全血于湿冰上存放，并在1小时内于1800×g，4℃下离心5分钟来获得血浆样品。分离取得的血浆样品会以4:1的比例加入2％甲酸摇荡均匀，立即放在干冰中暂存然后转移至-20℃冰箱中。采用lc/ms/ms进行检测，利用软件winnonlin的非室模型计算犬给药后的药代动力学参数，数据如表-1所示，图-5所示。

表1

结论：由上述试验结果可知，各组给药后，在体内均只检出泊马度胺，说明它们进入体内后均迅速代谢为泊马度胺。在相近的给药剂量下，本发明盐相比泊马度胺，cmax值升高4倍以上，auclast升高1.5倍以上，表明本发明的盐与泊马度胺相比具有更好的口服生物利用度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。