一株卓尔贝氏菌属细菌及其在提高植物抗逆性中的应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株卓尔贝氏菌属细菌及其在提高植物抗逆性中的应用。
背景技术：
：近年来，随着世界人口的增加，耕地的减少，一些盐碱化土壤被开发利用，盐碱化土壤有扩大的趋势。土壤盐碱化严重制约着全球农牧业的发展，尤其是在干旱和半干旱地区，盐碱危害和干旱胁迫相互叠加，严重威胁植物的生长，如何提高植物耐盐碱能力，促进植物生长，是盐碱化地区亟待解决的问题。盐碱胁迫对植物的危害主要表现在以下三点：(1)生理干旱：土壤中可溶性盐类过多，由于渗透势增高而使土壤水势降低，根细胞的水势高于土壤的水势所以导致根吸水困难，甚至植株体内水分还有外渗的危险；因而，盐害的通常表现实际上是旱害，尤其在大气相对湿度低的情况下，随蒸腾作用加强，盐害更为严重；植物细胞一旦脱水便会造成膜结构的破坏，使膜结构的稳定性下降，质膜的通透性增强。(2)离子的毒害：在盐分过多的土壤中植物生长不良的原因，不完全是生理干旱或吸水困难，而是由于吸收某种盐类过多而排斥了对另一些营养元素的吸收，产生了类似单盐毒害的作用。(3)破坏正常代谢：盐分过多会对光合作用、呼吸作用和蛋白质代谢产生很大影响。盐分过多会抑制叶绿素生物合成和各种酶的产生，尤其是影响叶绿素-蛋白复合体的形成，气孔导度下降，植物的光合能力降低。盐分过多还会使pep羧化酶与rubp羧化酶活性降低，使光呼吸加强。在盐碱胁迫下，植物体内会产生大量的活性氧，对质膜产生破坏作用，导致膜透性发生变化，结构和功能受损。同时植物体内的激素水平也会发生变化，如乙烯的积累增加，而另一些激素(如生长素、细胞分裂素)的合成减少，加速了植物的衰老和死亡。绿豆是豆科蝶形花亚科菜豆族豇豆属的一年生栽培种，在我国已有2000多年的栽培历史。绿豆作为一种重要的杂豆类作物，其营养丰富，属低脂肪、中淀粉、高蛋白，是药食同源的主要食用豆类作物，同时又是较好的出口创汇作物。我国是世界上最大的绿豆出口国，常年种植面积约为600万公顷，总产量约100万吨，全世界绿豆产量每年以2.5％的速度在增长。同时由于绿豆的生育期较短，是一种很好的轮作作物。玉米属于禾本科玉米属，是我国三大主要的粮食作物之一，种植面积和总产量仅次于水稻，位居第二位，而单位面积产量则居谷类作物之首。玉米是畜牧业的优质饲料，据统计，近代世界上玉米作为饲料用于生产奶、肉、蛋等畜产品，占总产量的75％-80％。玉米籽粒饲用价值较高，100kg玉米籽粒的饲用价值相当于135kg燕麦。同时，玉米的鲜嫩枝叶营养也比较丰富，其利用价值也较高。近年来，随着我国大农业的供给侧改革及畜牧业的重新布局，饲用玉米在农业及畜牧业中发挥的作用亦越来越重要。技术实现要素：本发明的目的是提高植物抗逆性。本发明首先保护卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1，该菌株已于2018年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2018587。卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587简称卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1。本发明还保护一种菌剂，该菌剂含有所述卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587。所述菌剂的用途可为提高植物的抗逆性(如盐碱胁迫抗性)。所述菌剂的制备方法包括如下步骤：将卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1接种至细菌培养基并进行培养，获得的菌液即为所述菌剂。所述细菌培养基可为改良s-g液体培养基。所述改良s-g液体培养基的制备方法具体可为：向氯化钠30g、酵母提取物10g、碳酸钠5.3g、碳酸氢钠8.4g、柠檬酸三钠3g、氯化钾2g、七水合硫酸镁1g、七水合硫酸亚铁0.05g和四水合二氯化锰0.0036g中加入蒸馏水，调节ph至9.5，用蒸馏水定容至1l，然后121℃灭菌15min。所述菌剂的制备方法中，所述培养的条件可为：25～35℃(如25～28℃、28～35℃、25℃、28℃或35℃)、150-200rpm(如150-175rpm、175-200rpm、150rpm、175rpm或200rpm)培养20～30h(如20～24h、24～30h、20h、24h或30h)。除了活性成分，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物。所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。本发明还保护所述卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587或上述任一所述菌剂的应用，可为a1)-a9)中的至少一种：a1)促进植物生根；a2)促进植物生长；a3)提高植物抗逆性；a4)增强植物对活性氧的清除能力；a5)提高植物的抗衰老能力；a6)固氮；a7)合成铁载体；a8)合成acc脱氨酶；a9)合成iaa。本发明还保护所述卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587或上述任一所述菌剂在制备产品中的应用；所述产品的功能可为a1)-a9)中的至少一种：a1)促进植物生根；a2)促进植物生长；a3)提高植物抗逆性；a4)增强植物对活性氧的清除能力；a5)提高植物的抗衰老能力；a6)固氮；a7)合成铁载体；a8)合成acc脱氨酶；a9)合成iaa。上述应用中，所述产品可为微生物肥料。上述任一所述的应用中，所述提高植物抗逆性可为提高植物盐碱胁迫抗性。所述盐碱胁迫抗性可为抗盐性、抗碱性和抗盐碱性中的三种、任两种或任一种。上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c6)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)豆科植物；c5)玉米；c6)绿豆。本发明还保护一种微生物肥料，其含有所述卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587或上述任一所述菌剂。本发明还保护b1)或b2)或b3)或b4)或b5)。b1)促进植物生根的方法，可为采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物，从而促进植物生根。b2)促进植物生长的方法，可为采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物，从而促进植物生长。b3)提高植物抗逆性的方法，可为采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物，从而提高植物抗逆性。b4)增强植物对活性氧的清除能力的方法，可为采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物，从而增强植物对活性氧的清除能力。b5)提高植物的抗衰老能力的方法，为采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物，从而增强植物对活性氧的清除能力。上述任一所述的方法中，所述“采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物”可通过向植物根系施加卓尔贝氏菌属细菌实现。上述任一所述的方法中，所述“采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物”还可通过向植物地上部分(如叶片)喷施卓尔贝氏菌属细菌实现。上述任一所述的方法中，所述“采用卓尔贝氏菌属细菌处理植物”具体可为采用上述任一所述菌剂处理植物。上述任一所述的方法中，所述“采用上述任一所述菌剂处理植物”可通过向植物根系施加上述任一所述菌剂实现。上述任一所述的方法中，所述“采用上述任一所述菌剂处理植物”还可通过向植物地上部分(如叶片)喷施上述任一所述菌剂实现。上述任一所述的方法中，所述卓尔贝氏菌属细菌可为所述卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587。上述任一所述的方法中，所述“采用所述卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587或上述任一所述菌剂处理植物”可为向植物根系施加所述微生物肥料或向植物地上部分(如叶片)喷施所述微生物肥料。上述任一所述的方法中，所述植物可为如下c1)至c6)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)豆科植物；c5)玉米；c6)绿豆。上述任一所述促进植物生根可为促进植物扦插条的生根。上述任一所述促进植物生长和/或所述提高植物抗逆性具体可表现为株高、鲜重、干重、叶绿素、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶活性中至少一种的增加。上述任一所述提高植物抗逆性可为提高植物抗盐碱性。所述盐碱胁迫抗性可为抗盐性、抗碱性和抗盐碱性中的三种、任两种或任一种。上述任一所述增强植物对活性氧的清除能力可表现为超氧化物歧化酶活性的增加。上述任一所述提高植物的抗衰老能力可表现为丙二醛含量的降低。上述任一所述微生物肥料可为复合微生物肥料和/或生物有机肥。所述复合微生物肥可为菌剂、营养物质和有机质复合而成的肥料。所述复合微生物肥既有微生物的作用，又有化肥的作用。所述生物有机肥可为菌剂和腐熟的有机肥复合而成的一类肥料。复合微生物肥料和/或生物有机肥的剂型可为颗粒剂。实验证明，向玉米或绿豆根系施加卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587，可以促进生长和提高对盐碱胁迫抗性，具体表现为株高、鲜重、干重、叶绿素、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶活性的增加；采用卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587处理绿豆扦插条，从而促进绿豆扦插条的生根。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为细菌dqsa1的16srrna系统发育树。图2为不同处理条件下绿豆扦插条的生根数量统计结果。图3为水浸泡时绿豆扦插条的根部表型。图4为盐碱胁迫液浸泡时绿豆扦插条的根部表型。图5玉米幼苗地上部分的表型。图6绿豆幼苗地上部分的表型。保藏说明菌种名称：卓尔贝氏菌属拉丁名：zobellellasp.菌株编号：dqsa1保藏机构：中国典型培养物保藏中心保藏机构简称：cctcc地址：中国武汉大学保藏日期：2018年09月03日保藏中心登记入册编号：cctccno：m2018587具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的光暗交替培养即16h光照培养和8h黑暗培养交替进行，光照培养时的光照强度为60μmolm-2s-1；相对湿度均为70％。改良s-g液体培养基：向氯化钠30g、酵母提取物10g、碳酸钠5.3g、碳酸氢钠8.4g、柠檬酸三钠3g、氯化钾2g、七水合硫酸镁1g、七水合硫酸亚铁0.05g和四水合二氯化锰0.0036g中加入蒸馏水，调节ph至9.5，用蒸馏水定容至1l，然后121℃灭菌15min。改良s-g固体培养基：向改良s-g液体培养基中加入琼脂并使其浓度为20g/l；然后121℃灭菌15min。改良s-g固体平板：将冷却至约55℃的改良s-g固体培养基倒入培养皿，自然冷却。阿须贝无氮培养基：向磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.2g、七水合硫酸镁0.5g、硫酸钙0.2g、二水合硫酸钾0.2g、碳酸钙5g、葡萄糖10g和琼脂20g中加入蒸馏水，调节ph至7.0，用蒸馏水定容至1l，然后121℃灭菌15min。adf培养基：向磷酸二氢钾4.0g、磷酸氢二钠6.0g、七水合硫酸镁0.2g、七水合硫酸亚铁0.1g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、0.1ml微量元素溶液和acc3.0mmol中加入蒸馏水，调节ph至7.5，用蒸馏水定容至1l，然后121℃灭菌15min。微量元素溶液为含硼酸100mg/l、七水合硫酸镁112mg/l、硫酸锌1.246g/l、五水合硫酸铜782mg/l和三氧化钼100mg/l的水溶液。king培养基：向水解蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、七水合硫酸镁1.5g和甘油10ml中加入蒸馏水，调节ph至7.2，用蒸馏水定容至1l，然后121℃灭菌15min。染液c：将a溶液沿瓶壁缓慢加入b溶液中，充分混匀即得染液c。溶液a：将0.024g铬天青溶于20ml双蒸水，然后和4ml三氯化铁溶液(溶剂为水)(浓度为1mmol/l)混匀，得到溶液即为溶液a。溶液b：将0.030g十六烷基三甲基溴化铵溶于16ml双蒸水，得到的溶液。培养基d：取盛有300ml双蒸水的容器，加入40ml10×mm9盐溶液，混匀；然后用氢氧化钠水溶液(浓度为1m)调节ph值至6.8；最后加入6.4g琼脂粉，得到培养基d。10×mm9盐溶液：向磷酸氢二钠30g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠2.5g、氯化铵5g中加入双蒸水500ml，充分溶解后即为10×mm9盐溶液。将培养基d、染液c、氯化钙溶液(溶剂为水)(浓度为1mmol/l)、硫酸镁溶液(溶剂为水)(浓度为1mmol/l)、葡萄糖溶液(溶剂为水)(浓度为20g/100ml)和酪蛋白氨基酸溶液(溶剂为水)(浓度为10g/100ml)分别121℃灭菌20min，冷却至约50℃；向冷却至约50℃的培养基d中加入冷却至约50℃的氯化钙水溶液0.4ml、硫酸镁溶液8ml、葡萄糖水溶液4ml、酪蛋白氨基酸水溶液12ml，再沿瓶壁缓慢加入冷却至约50℃的染液c，充分摇匀，得到蓝色定性检测培养基，即cas培养基。实施例1、卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587的分离、鉴定和保藏一、细菌dqsa1的分离1、在90ml无菌水中加入10g盐碱土壤样品(采自中国黑龙江省大庆市龙凤区的盐碱草原)，28℃振荡20min，静止放置10min，然后取上清液1ml，加入盛有9ml无菌水中的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的无菌试管中混合均匀，以此类推制成10-2、10-3不同稀释度的菌悬液。2、完成步骤1后，将0.2ml稀释度为10-3的菌悬液均匀涂布在改良s-g固体平板上，28℃恒温静置培养7d。3、完成步骤2后，挑取改良s-g固体平板上菌落形态不同的单菌落，反复纯化3次以上，然后用50％(v/v)甘油水溶液保存菌种，-40℃保存备用。4、在阿须贝无氮培养基上分别点种步骤3纯化得到的每株菌的菌悬液10μl(每株菌在阿须贝无氮培养基上重复3次)，28℃培养7d，然后观察。如果某株菌能在阿须贝无氮培养基上生长，则说明该株菌具有固氮功能。5、在adf培养基上分别点种步骤3纯化得到的每株菌的菌悬液10μl(每株菌在adf培养基上重复3次)，28℃培养7d，然后观察。如果某株菌能在adf培养基上生长(即可以将acc作为唯一氮源进行生长)，则说明该株菌可以合成acc脱氨酶。6、在cas培养基上分别点种步骤3纯化得到的每株菌的菌悬液10μl(每株菌在cas培养基上重复3次)，28℃培养7d，然后观察。如果某株菌能在cas培养基上生长且形成橘黄色晕圈，则说明该株菌具有合成铁载体功能。铁载体是微生物和部分植物在低铁应激条件下产生的一种能够高效率络合三价铁离子的低分子量有机化合物。铁载体的能力强弱可以影响植物对三价铁离子的吸收。铁载体可以溶解并结合土壤中的铁元素供植物利用，从而增加铁营养，促进植物生长。7、向含100mg/ml色氨酸的king培养基中分别接种步骤3纯化得到的每株菌的单克隆(每株菌设3个重复)，避光条件下，28℃、175rpm振荡培养24h，得到培养菌液；取所述培养菌液，12000rpm离心5min，收集上清液；将所述上清液与pc比色液(将1.2gfecl3溶于50ml蒸馏水中，然后缓慢加入42.97ml浓硫酸，待冷却后用蒸馏水定容至100ml)等体积混匀，然后置于白瓷板上，黑暗条件下放置30min后观察显色情况。将含100mg/ml色氨酸的king培养基与salkowski比色液等体积混匀，然后置于白瓷板上，黑暗条件下放置30min后观察显色情况(作为空白对照)。如果某株菌能发生显色反应且空白对照不能发生显色反应，则说明该株菌可以合成iaa。8、经过步骤4-7，筛选到一株细菌，将其命名为细菌dqsa1。细菌dqsa1可以在阿须贝无氮培养基和adf培养基上生长，也可以在cas培养基上生长且形成橘黄色晕圈，还可以在含100mg/ml色氨酸的king培养基中生长且发生显色反应。由此可见，细菌dqsa1具有固氮功能、具有合成铁载体功能，还可以合成acc脱氨酶和iaa。二、细菌dqsa1的鉴定1、形态学鉴定(1)将细菌dqsa1接种至改良s-g固体平板上，5天后观察单菌落的形态。结果表明，细菌dqsa1呈圆形，淡粉色，菌落表面凸起，湿润，光滑，有光泽，边缘整齐。(2)细菌dqsa1经革兰氏染色后，鉴定为革兰氏阴性菌。(3)采用高分辨率透射电镜观察细菌dqsa1的形态。结果表明，细菌dqsa1的菌体为杆状。2、生理生化特征分析参考文献(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[m].北京：科学技术出版社，2001：365)中的方法测定细菌dqsa1的生理生化特征。结果表明，细菌dqsa1好氧，接触酶试验阳性，可利用β-甲基d-葡萄糖苷、d-木糖、d-甘露醇、n-乙酰基-d-葡萄胺、d-纤维二糖、d，l-α-甘油、丙酮酸甲脂、α-羟基丁酸、α-丁酮酸、d-苹果酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺酸、l-苯基丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、甘氨酰-l-谷氨酸、吐温40、吐温80、4-羟基苯甲酸、肝糖和腐胺作为唯一碳源或氮源。3、16srrna序列同源性分析经检测，细菌dqsa1的16srrna的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。将序列表中的序列1所示的双链dna分子和ezbiocloud数据库中的序列进行比对分析。制作16srrna系统发育树。16srrna系统发育树见图1。结果表明，细菌dqsa1与zobellelladenitrificanszd1的相似度为96.59％。三、细菌dqsa1的保藏根据上述形态学鉴定结果、生理生化特征分析结果和16srrna序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的细菌dqsa1鉴定为卓尔贝氏菌属细菌。细菌dqsa1已于2018年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2018587。细菌dqsa1的全称为卓尔贝氏菌属(zobellellasp.)dqsa1cctccno：m2018587，简称卓尔贝氏菌属dqsa1。实施例2、卓尔贝氏菌属dqsa1可以促进绿豆扦插条的生根1、绿豆扦插条的获得(1)挑选饱满的绿豆种子，用清水冲洗2h。(2)完成步骤(1)后，取所述绿豆种子，先用0.1％(v/v)次氯酸钠水溶液消毒30min，然后用无菌水冲洗10min。(3)完成步骤(2)后，将所述绿豆种子置于无菌水中浸泡12h，然后播种于无菌蛭石中，先27±2℃黑暗培养48h，再27±2℃光暗交替培养3d，得到绿豆幼苗。(4)完成步骤(3)后，选取长势、子叶大小、下胚轴粗细基本一致的绿豆幼苗，切去子叶4cm以下的下胚轴和根系，得到绿豆扦插条。2、dqsa1菌剂的制备(1)将卓尔贝氏菌属dqsa1单菌落接种于装有100ml改良s-g液体培养基的锥形瓶(规格为250ml)中，28℃、175rpm振荡培养24h，得到菌液1。(2)完成步骤(1)后，取菌液1，10000g离心10min，收集菌体。(3)完成步骤(2)后，取所述菌体，用无菌生理盐水洗涤三次，然后用无菌生理盐水重悬，得到od600nm值约为0.5的菌液2。菌液2即为制备的dqsa1菌剂。3、绿豆扦插条的生根(1)取步骤(1)制备的4个绿豆扦插条，置于dqsa1菌剂(目的为接菌)或水中浸泡24h。(2)完成步骤(1)后，先用无菌水冲洗绿豆扦插条的基部，然后插入装有盐碱胁迫液(浓度为10mm的碳酸钠水溶液)或水的离心管内，27±2℃光暗交替培养7d。培养期间，每天更换离心管内的溶液。(3)完成步骤(2)后，统计绿豆扦插条的生根数量，然后按组取平均值。绿豆扦插条的生根数量统计结果见图2(ck为水浸泡且不接菌，s为盐碱胁迫液浸泡且不接菌，b为水浸泡且接菌，bs为盐碱胁迫液浸泡且接菌)。水浸泡时，绿豆扦插条的根部表型见图3(左图为不接菌，右图为接菌)。盐碱胁迫液浸泡时，绿豆扦插条的根部表型见图4(左图为不接菌，右图为接菌)。结果表明，卓尔贝氏菌属dqsa1可以促进绿豆扦插条的生根。在正常生长条件下(即水浸泡，没有盐碱胁迫)，与未接种卓尔贝氏菌属dqsa1的绿豆扦插条相比，接种卓尔贝氏菌属dqsa1的绿豆扦插条的生根数量提高了60％。在盐碱胁迫条件下(即盐碱胁迫液浸泡)，与未接种卓尔贝氏菌属dqsa1的绿豆扦插条相比，接种卓尔贝氏菌属dqsa1的绿豆扦插条的生根数量提高了111.11％。实施例3、卓尔贝氏菌属dqsa1提高玉米和绿豆的抗盐碱胁迫的能力盐碱土采集于中国黑龙江省大庆市盐碱草原，其ph值为8.34，碱化度为34.28％，可溶性盐含量为0.77％。非盐碱土采集于中国黑龙江省大庆市大同区农田，其ph值为6.56，碱化度为7.60％，可溶性盐含量为0.10％。检测玉米幼苗的叶绿素含量的方法参考如下文献：马嘉敏.苜蓿根际促生菌的分离及促生作用研究[d].哈尔滨师范大学，2013。检测玉米幼苗的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的方法均参考如下文献：张志良，瞿伟菁，李小方.植物生理学实验指导[m].北京：高等教育出版社，2006：100－227。一、dqsa1菌剂的制备(1)将卓尔贝氏菌属dqsa1的单菌落接种于装有300ml改良s-g液体培养基的锥形瓶(规格为500ml)中，28℃、175rpm振荡培养24h，得到菌液1。(2)完成步骤(1)后，取菌液1，10000g离心10min，收集菌体。(3)完成步骤(2)后，取所述菌体，用无菌生理盐水洗涤三次，然后用无菌水重悬，得到浓度为109cfu/ml的菌液2。菌液2即为制备的dqsa1菌剂。二、卓尔贝氏菌属dqsa1可以促进玉米的生长1、玉米幼苗的获得a、盐碱土+dqsa1玉米幼苗的获得(1)取装有盐碱土的方槽，向盐碱土中接种菌液2(接种剂量为107cfu/g土)。(2)完成步骤(1)的2天后，播种催芽后的玉米，27±2℃光暗交替培养。(3)待步骤(2)中的玉米出苗第10天，向盐碱土中接种菌液2(接种剂量为0.5×106cfu/g土)，然后27±2℃光暗交替培养30天，得到盐碱土+dqsa1玉米幼苗。b、盐碱土玉米幼苗的获得(1)取装有盐碱土的方槽，播种催芽后的玉米，27±2℃光暗交替培养。(2)待步骤(1)中的玉米出苗第10天，27±2℃光暗交替培养30天，得到盐碱土玉米幼苗。c、非盐碱土玉米幼苗的获得(1)取装有非盐碱土的方槽，播种催芽后的玉米，27±2℃光暗交替培养。(2)待步骤(1)中的玉米出苗第10天，27±2℃光暗交替培养30天，得到非盐碱土玉米幼苗。2、检测玉米幼苗(盐碱土+dqsa1玉米幼苗、盐碱土玉米幼苗或非盐碱土玉米幼苗)的株高、鲜重、干重、叶绿素含量(用spad值表示)、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(sod)活性和丙二醛(mda)含量。玉米幼苗地上部分的表型见图5(从左至右依次为盐碱土玉米幼苗、盐碱土+dqsa1玉米幼苗和非盐碱土玉米幼苗)。玉米幼苗的检测结果见表1和表2：与未施加卓尔贝氏菌属dqsa1的盐碱土相比，在施加卓尔贝氏菌属dqsa1的盐碱土上种植的玉米的株高、鲜重、干重、叶绿素、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶活性均显著增加，丙二醛含量则显著降低。结果表明，卓尔贝氏菌属dqsa1可以促进玉米的生长，增强玉米植物对活性氧的清除能力，提高玉米植物的抗衰老能力。表1处理株高(cm)鲜重(g)干重(g)叶绿素(spad值)非盐碱土玉米幼苗69.7±8.210.195±3.5130.912±0.00927.171±2.635盐碱土玉米幼苗63.0±5.17.320±1.5230.460±0.00526.286±2.608盐碱土+dqsa1玉米幼苗66.0±4.68.238±1.9630.765±0.00632.971±2.111盐碱土绿豆幼苗16.6±2.20.827±0.1500.118±0.00316.058±2.460盐碱土+dqsa1绿豆幼苗18.1±2.30.914±0.1160.144±0.00231.550±2.537表2三、卓尔贝氏菌属dqsa1可以促进绿豆的生长1、绿豆幼苗的获得a、盐碱土+dqsa1绿豆幼苗的获得(1)取装有盐碱土的方槽，向盐碱土中接种菌液2(接种剂量为107cfu/g土)。(2)完成步骤(1)的2天后，播种催芽后的绿豆，27±2℃光暗交替培养。(3)待步骤(2)中的绿豆出苗第10天，向盐碱土中接种菌液2(接种剂量为0.5×106cfu/g土)，然后27±2℃光暗交替培养30天，得到盐碱土+dqsa1绿豆幼苗。b、盐碱土绿豆幼苗的获得(1)取装有盐碱土的方槽，播种催芽后的绿豆，27±2℃光暗交替培养。(2)待步骤(1)中的绿豆出苗第10天，27±2℃光暗交替培养30天，得到盐碱土绿豆幼苗。2、检测绿豆幼苗(盐碱土+dqsa1绿豆幼苗或盐碱土绿豆幼苗)的株高、鲜重、干重、叶绿素含量(用spad值表示)、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(sod)活性和丙二醛(mda)含量。绿豆幼苗地上部分的表型见图6(从左至右依次为盐碱土+dqsa1绿豆幼苗和盐碱土绿豆幼苗)。绿豆幼苗的检测结果见表1和表2：与未施加卓尔贝氏菌属dqsa1的盐碱土相比，在施加卓尔贝氏菌属dqsa1的盐碱土上种植的绿豆的株高、鲜重、干重、叶绿素、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶活性均显著增加，丙二醛含量则显著降低。结果表明，卓尔贝氏菌属dqsa1可以促进绿豆的生长，增强绿豆植物对活性氧的清除能力，提高绿豆植物的抗衰老能力。由此可见，卓尔贝氏菌属dqsa1能够提高玉米和绿豆的抗逆性，如抗盐碱胁迫的能力增加。<110>黑龙江八一农垦大学<120>一株卓尔贝氏菌属细菌及其在提高植物抗逆性中的应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1439<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1tgcacatggcgggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgct60acttttgccggcgagcggcggacgggtgagtaaggcttgggtatctgcccagtcgagggg120gataaccgttggaaacgacggctaataccgcatacgccctgcgggggaaagcaggggatc180ttcggaccttgcgcgattggatgagcccaagtgagattagctagttggtgaggtaatggc240tcaccaaggcgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactgggactgaga300cacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccct360gatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagtggtg420aggaaaggcaagcggcgaatacccgcttgctgtgacgttaaccacagaagaagcaccggc480taactccgtgccagcagccgcggtatacggagggtgcaagcgttaatcggaatgactggg540cgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagccagatgtgaaagccccgagctcaacttggg600aactgcatttggaactggcaagctagagtcttggagaggggggcagaatttccggtgtag660cggtgaaatgcgtagagatcggaaggaataccagtggcgaaggcggccccctggccaaag720actgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccac780gctgtaaacgatgtcaacttggagtctgtgccatttgagcgcgggttccggagctaacgc840gttaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggg900gcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctac960ccttgacatagtaagaacttggcagagatgccttggtgccttcgggaacttacatacagg1020tgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcg1080caacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccggtgat1140aaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgggtagggctacac1200acgtgctacaatggcgcgtacagagggcggcgaaccagcgatggtaagcgaatcccaaaa1260agcgcgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactccgtgaagtcggaatcgctagt1320aatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtca1380caccatgggagtgggttgctccagaagtagatagcttaacctttcggggaggggggccg1439当前第1页12