常温下一种粪便样本的DNA保存液及其制备方法和用途与流程

本发明属于微生物样本保藏领域，具体涉及常温下一种粪便样本的dna保存液及其制备方法和用途。

背景技术：

近年来，随着第二代测序技术的发展和生物信息学分析方法的日益完善，已证明肠道微生物与多种疾病的发生发展密切相关。其中以16srdna技术为代表，16srdna存在于所有细菌染色体基因中，可以编码16srrna相对应的dna序列，该序列包含9个高变区和10个保守区。保守区反映了生物物种间的亲缘关系，而高变区则能体现物种间的差异。通过设计引物扩增高变区的序列，然后进行二代测序，运用生物信息学分析方法进一步区分菌种。目前此方法广泛应用于菌种的鉴定。

人体内存在着比体细胞数高达数十倍甚至上百倍的微生物，其广泛分布在口腔、消化道、呼吸道、皮肤表面、生殖道以及肠道。其中肠道是人体最大的微生态系统，寄宿着约10¹⁴个微生物。从功能上可将这些微生物分为三大类：益生，共生和病原微生物，其中以细菌为主，也包括真菌、病毒和噬菌体，它们在肠道内维持着一个动态平衡。人体粪便的采集是反映肠道微生物和健康状况的最直接方式。尽管肠道微生物的构成是相对稳定的，但随着年龄阶段的不同、饮食习惯和生活方式以及健康状况的改变，微生物菌群也会发生很大的变化。因此，定期检测肠道微生物构成的改变可以有效监测人体的健康状况。

由于人体肠道为微生物提供了最适宜的生长环境，一旦脱离人体后，大多数微生物的增长与死亡速率会发生很大的改变，不能准确的反映机体的健康状况。目前通用的保存方法是将采集好的粪便样本立即低温冻存，尤其是-80℃的冻存效果较好。然而此方法实用性较差，除了专业机构外，一般没有低温设备可供保存样本。因此，寻求一种可以稳定微生物构成的保存方法尤为重要。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题是克服目前低温保存方法的缺陷，从而提出一种操作简便，可长期常温保存及运输的保存液。受检者可任何时候完成样品的采集，只需将样品浸入此保存液中就可达到稳定微生物构成的目的。

本发明所采用的技术方案如下：常温下一种粪便样本的dna保存液的制备方法，该方法为用无菌水溶解20-50mm的三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)缓冲液、10-50mm的乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)、100-150mm的氯化钠(nacl)和质量分数为0.1％-0.5％的十二烷基硫酸钠(sds)，再调制ph至8.0，最后获得dna保存液。

进一步的，所述三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)缓冲液的摩尔浓度为40mm。

进一步的，所述乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)的摩尔浓度为45mm。

进一步的，所述氯化钠(nacl)的摩尔浓度为140mm。

进一步的，所述十二烷基硫酸钠(sds)的质量分数为0.3％。

本发明还提供由上述的制备方法制备得到的dna保存液。

本发明还提供由上述制备方法制备得到的dna保存液在常温下保存粪便样本dna中的用途。

与现有的低温保存方法相比，上述所述保存液具有以下优点：可长期常温放置及运输，且操作简便，只需将粪便样本浸入上述保存液中即可达到稳定微生物构成的目的。上述保存液大大地改善了实用性能，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是不同处理方式的样本dna凝胶电泳结果；

图2是不同处理方式的样本菌群丰度结果；

图3是不同处理方式的样本菌群构成结果。

具体实施方式

实施例1：dna保存液的制备

用无菌水溶解20mm的三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)缓冲液、10mm的乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)、100mm的氯化钠(nacl)和质量分数为0.1％的十二烷基硫酸钠(sds)，调制ph至8.0，获得保存液。

实施例2：dna保存液的制备

用无菌水溶解50mm的三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)缓冲液、10-50mm的乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)、150mm的氯化钠(nacl)和质量分数为0.5％的十二烷基硫酸钠(sds)，调制ph至8.0，获得保存液。

实施例3：dna保存液的制备

用无菌水溶解40mm的三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)缓冲液、45mm的乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)、140mm的氯化钠(nacl)和质量分数为0.3％的十二烷基硫酸钠(sds)，调制ph至8.0，获得保存液。

实施例4:样本来源及保存方式

本实施例的粪便样本来自3位志愿者，每位志愿者采集4份，分别做4种不同的处理。

1)室温3小时：将采集的0.2g新鲜粪便样本密封避光，室温放置三小时。

2)冻存一周：将采集的0.2g新鲜粪便样本密封避光，-80℃低温储存一周。

3)配方1保存一周(本发明实施例3的配方)：将采集的0.2g新鲜粪便样本浸入本发明配方中，充分混匀，密封避光，室温下(25℃)存放7天。

4)配方2保存一周(现有配方)：将采集的0.2g新鲜粪便样本浸入现有配方中，充分混匀，密封避光，室温下(25℃)存放7天。

所述配方2(现有配方)见表1

实施例5:实验操作流程

1.dna提取前预处理：对3)和4)的样本进行离心，12000rpm，10分钟，弃掉上清液。

2.dna提取：根据qiaampfastdnastoolminikit说明书进行dna提取，电泳凝胶检测dna片段的完整性。

3.送测序公司进行16srrna基因v3/v4区扩增和测序，获取测序结果。

4.对测序结果进行生物信息学分析，得到菌群结果。

实施例6:不同处理方式的样本dna凝胶电泳结果

样本dna凝胶电泳结果如图1所示，dna主带清晰，则说明成功的提取了粪便样本的dna。结果表明，经四种处理方式保存的粪便样本都可以成功的提取dna，说明不同保存方式对粪便样本dna的提取影响不大。

实施例7:不同处理方式的样本菌群丰度结果

通过生物信息学统计分析，四种不同处理方式的样本香农多样性指数结果如图2和表2所示，数值越高，代表该样本中的菌群种类越多，即菌群丰富程度越高。结果表明：配方1保存一周的结果与冻存一周及配方2保存一周的结果接近，室温3小时的结果较差。

实施例8:不同处理方式的样本菌群构成结果

通过生物信息学统计分析，计算四种不同处理方式的门水平的菌群相对丰度，结果如图3所示，若某种菌在样本中含量较多，则在柱状图中所占的比例就越多。结果表明：配方1保存一周的菌群相对丰度与冻存一周的最接近，其次是室温3小时，最后是配方2保存一周。

基于上述对样本的菌群丰度和菌群构成的分析，结果表明本发明配方的保存效果不亚于冻存和现有配方，且明显好于室温3小时的保存方案。

最后要指出的是，上述的实施例仅用于帮助本领域的技术人员理解本发明的实质，但并不能用作对本发明保护范围的限定。例如，基于本发明技术原理的前提下，作出的改进和变型也视为本发明的保护范围。