比例传感型锌离子荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于离子识别技术领域，具体涉及一种比例传感型锌离子荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是主要发生在老年人的常见的慢性进行性神经功能衰退性疾病，其典型的病理特征包括β-淀粉样蛋白(aβ)沉积形成老年斑以及神经元内纤维缠结、大脑淀粉样血管病和神经元凋亡等。由于缺乏有效的治疗手段，目前在发达国家ad已成为继心脏病、癌症和中风之后第四位危害人类健康的致死性疾病近年来的研究发现，金属离子尤其是锌离子(zn²⁺)在大脑aβ沉积过程中起关键作用并参与ad的发病进程。因此对锌离子的浓度进行检测具有重要的意义。

锌离子本身是满壳层电子构型(3d¹⁰4s⁰)，没有d-d电子跃迁，故锌离子是无色的。锌的配合物中的锌离子也是极其稳定的，不存在金属和配体之间的电子转移。而且锌离子是反磁性的，核自旋为零。因此不存在常见光谱如uv光谱、epr光谱、nmr的信号，常规谱学分析手段对锌离子没有直接响应。另一方面，由于锌离子不猝灭荧光，利用化学荧光探针染色可以实现对细胞或组织中锌离子的造影分析，获得锌离子的时空分布信息。

目前报道的锌离子探针主要有两类：(1)锌离子结合后导致荧光增强的增强型探针；(2)锌离子结合导致激发(或发射)波长明显移动的比例传感型荧光探针。

增强型探针的荧光易受胞内或组织内环境影响，而且进入细胞和组织的探针分子浓度未知，因此难以提供锌离子动态变化的定量信息。比例传感型荧光探针利用其自由探针分子和锌离子结合态探针分子各自发射(或激发)带的比例变化可以实现对锌离子的定量检测，不受体内环境影响及探针分子浓度影响。因此合成比例传感型锌离子荧光探针具有较好的应用前景。

中国专利cn201711073438公开了一类邻菲啰啉衍生物、锌离子荧光探针及其应用，在邻菲罗啉母环中以单键引入共轭荧光团，所制备的比例传感型荧光探针对除锌离子外的其他金属离子也表现出荧光发射波长的移动，特别是同主族的镉离子，因此并不是专一性识别锌离子的探针。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种比例传感型锌离子荧光探针，能够定量检测锌离子的浓度，选择性好，灵敏度高，锌离子的检测限低；本发明还提供其制备方法，合成工艺简单，易于实现，本发明还提供其应用。

本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针，其结构式如下：

中文名为2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉。

本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：以四(三苯基膦)钯为催化剂，将3,5-二溴苯甲醛、吡啶-4-硼酸、碳酸钾加入到甲苯、乙醇和水的混合溶剂中，加热回流反应，得产物3,5-二(4-吡啶)苯甲醛；将1,10-菲啰啉-5,6-二酮、3,5-二(4-吡啶)苯甲醛、对甲基苯胺和醋酸铵溶于乙酸中，加热回流反应，得所述的比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉。

本发明的反应方程式如下：

其中：

四(三苯基膦)钯、3,5-二溴苯甲醛、吡啶-4-硼酸、碳酸钾、甲苯、乙醇和水的用量比为1：9-11：22-28：120-128：45-55：45-55：45-55，其中，四(三苯基膦)钯、3,5-二溴苯甲醛、吡啶-4-硼酸、碳酸钾以毫摩尔数计，甲苯、乙醇、水以毫升计。

1,10-菲啰啉-5,6-二酮、3,5-二(4-吡啶)苯甲醛、对甲基苯胺、醋酸铵和乙酸的用量比为1：1：1.3-1.6：4-6：3.5-4.5，其中，1,10-菲啰啉-5,6-二酮、3,5-二(4-吡啶)苯甲醛、对甲基苯胺、醋酸铵以毫摩尔数计，乙酸以毫升计。

作为一种优选的技术方案，本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)氮气保护下，以四(三苯基膦)钯为催化剂，将3,5-二溴苯甲醛、吡啶-4-硼酸、碳酸钾加入到甲苯、乙醇和水的混合溶剂中，加热回流反应，反应完毕后，以二氯甲烷萃取反应液，萃取物旋蒸浓缩得粗产物，柱层析提纯得产物3,5-二(4-吡啶)苯甲醛；

(2)将1,10-菲啰啉-5,6-二酮、3,5-二(4-吡啶)苯甲醛、对甲基苯胺和醋酸铵溶于乙酸中，加热回流反应，反应完毕后加入去离子水过滤，沉淀水洗，柱层析提纯得所述的比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉。

步骤(1)中加热回流反应的时间为30-40小时。

步骤(1)中四(三苯基膦)钯和二氯甲烷的用量比为1：150-180，其中，四(三苯基膦)钯以毫摩尔数计，二氯甲烷以毫升计。

步骤(1)中柱层析采用200-300目柱层析硅胶，洗脱液采用二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷和甲醇的体积比为79-81:1，优选为80:1。

步骤(1)采用甲苯、乙醇和水作为混合溶剂，产品的产率和纯度高。

步骤(2)中加热回流反应的时间为18-24小时。

步骤(2)中1,10-菲啰啉-5,6-二酮和去离子水的用量比为1：2.5-4.0，其中，1,10-菲啰啉-5,6-二酮以毫摩尔数计，去离子水以毫升计。

步骤(2)中柱层析采用200-300目柱层析硅胶，洗脱液采用二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷和甲醇的体积比为19-21:1，优选为20:1。

本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针的应用，应用于锌离子浓度的检测。

综上所述，本发明具有以下优点：

(1)本发明以芳基咪唑为荧光团，以邻菲罗啉为锌离子识别基团，通过分子内电荷转移效应实现对锌离子的比例传感，其选择性好，灵敏度高；是一种比例传感型锌离子荧光探针，能够定量检测锌离子的浓度。

(2)本发明是通过debus-radziszewski反应在邻菲啰啉母核的5,6位修饰上带有共轭荧光团的咪唑环，增大了邻菲啰啉的刚性平面结构，能够定量检测锌离子的浓度，与现有技术相比，本发明的探针只针对锌离子表现出发射波长的移动，选择性好，灵敏度高，锌离子的检测限低。

(3)本发明提供的制备方法，合成工艺简单，易于实现，比例传感型锌离子荧光探针产率较高，在空气中稳定性好；其制备方法简单易行，适合工业化生产。

(4)本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针应用于锌离子浓度的检测，选择性好，灵敏度高，检测限低，锌离子的检测限是0.716μm。

附图说明

图1是本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针的金属离子的选择性荧光图；

图2是本发明所述的比例传感型锌离子荧光探针的锌离子荧光滴定曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种比例传感型锌离子荧光探针，制备方法为：

(1)n2保护下，1mmol四(三苯基膦)钯、10mmol3,5-二溴苯甲醛、25mmol吡啶-4-硼酸、125mmol碳酸钾溶于50ml甲苯、50ml乙醇和50ml水的混合溶剂中，加热回流36h，反应后静置冷却，160ml二氯甲烷进行萃取，减压蒸除溶剂，柱层析提纯(二氯甲烷和甲醇以体积比为80:1混合)得3,5-二(4-吡啶)苯甲醛，产率为90％；

(2)10mmol1,10-菲啰啉-5,6-二酮、10mmol3,5-二(4-吡啶)苯甲醛、15mmol对甲基苯胺、50mmol醋酸铵溶于40ml乙酸中，加热回流反应。加入30ml去离子水过滤，沉淀水洗，柱层析提纯(二氯甲烷和甲醇以体积比为20:1混合)得比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉。所述产物为灰绿色粉末状固体，产率为60％。

该化合物经核磁、质谱、元素分析进行了验证，结果表明结构正确，结构式如下：

其数据如下：

核磁¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ：2.63(s,3h)，7.33(q,1h)，7.37(d,4h)，7.51-7.61(m,5h)，7.73(q,1h)，7.81(s,1h)，7.92(d,2h)，8.67(d,4h)，9.05(d,1h)，9.13(d,1h)，9.18(d,1h)。

质谱esi-ms：541.2([m]⁺)。

元素分析anal.calcdforc36h24n6：c,79.98；h,4.47；n,15.55.found：c,80.14；h,4.46；n,15.61％。

对实施例制备得到的比例传感型锌离子荧光探针进行检测。

分别配置6mm金属离子溶液，所用到的金属离子有：na⁺，k⁺，ca²⁺，ni²⁺，cu²⁺，zn²⁺，cd²⁺，溶剂为二次蒸馏水。配置5.0×10^-5m的2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉溶液，溶剂为乙醇和hepes(ph＝7.2)缓冲液以体积比为1:1混合得到。

1、比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉对金属离子的选择性作用检测。

利用荧光仪测定2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5]1,10菲啰啉对金属离子的选择性：取3ml上述比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5]1,10菲啰啉溶液，分别加入1当量25μl的不同金属离子溶液，混合均匀进行荧光光谱扫描，激发波长350nm。如图1所示，加入1当量的金属离子后，只有zn²⁺发生红移现象，最大吸收峰由加入zn²⁺之前的412nm变为456nm，红移了44nm，其他离子如na⁺、k⁺、ca²⁺、ni²⁺、cu²⁺、cd²⁺的最大吸收峰仍然为412nm，没有发生红移。说明2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉对锌离子有较好的选择性，且为比例传感型荧光探针。

2、比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉对锌离子识别作用检测。

取3ml上述比例传感型锌离子荧光探针2-(3,5-二(4-吡啶基)苯基)-1-对甲苯基-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]菲啰啉溶液，分别加入0.1-1当量的锌离子溶液，混合均匀进行荧光光谱扫描，激发波长350nm。以加入体系中zn²⁺的浓度与探针的浓度的比值为横坐标，以456nm和412nm处荧光强度的比值为纵坐标，研究结果见图2，在加入0.5当量锌离子后，荧光强度比值基本不变，在0-0.5当量的范围内，很好的符合线性关系。锌离子的检测限是0.716μm。