一种通过抑制OsSDM基因表达提高水稻耐盐性的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过抑制ossdm基因表达提高水稻耐盐性的方法。

背景技术：

在水稻的生长发育过程中会受到各种各样的非生物胁迫，如高盐、高温、干旱及冷害等。水稻最早起源于淡水沼泽环境，是一种对盐胁迫中度敏感的作物，土壤盐化自然也成为了影响水稻产量的主要不利因素之一。

盐胁迫是由土壤或溶液中高浓度的盐离子引发而产生的对作物的危害作用，包括直接的离子毒害作用和间接的渗透胁迫、离子失衡和营养缺乏等。盐胁迫几乎会影响水稻所有的生长代谢过程。在盐胁迫下，水稻会产生各种生理生化变化，根据前人的研究，盐胁迫对水稻的伤害机制主要有以下几方面：(1)过多的盐离子破坏水稻细胞质膜的完整性，导致其选择透过性能下降直至消失，从而使细胞内na⁺、cl^-等离子大量积累，k⁺、ca²⁺等营养元素则大量外渗，引起细胞内离子浓度的动态平衡失调，破坏细胞膜和细胞器的结构，引起叶片的气孔导度、叶绿素含量以及核酸含量等下降，引发一系列的代谢紊乱，使细胞的功能下降，加速衰老或死亡；(2)高盐降低土壤溶液的水势，形成水分胁迫，使水稻根部吸水困难，细胞内盐分浓度提高，从而生理代谢失调，进而影响水稻的出苗和生长发育；(3)盐分胁迫促使活性氧o2^-、h2o2、oh等的产量增加，破坏或减弱细胞内抗氧化系统如超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pox)、谷胱甘肽(gsh)、抗坏血酸(asc)等的活性或含量，从而影响体内活性氧代谢系统的平衡；活性氧含量的增加能加剧膜质过氧化，破坏膜的完整性，选择透过性丧失，电解质及某些小分子有机物大量渗入，物质交换平衡被破坏，使水稻收到伤害；(4)盐胁迫降低了光合速率，同化物和能量的供给减少，抑制蛋白质的合成，此外水稻为了适应高盐环境和维持其生长，需要消耗更多的能量来进行离子的主动吸收和运输、区域化分配以及渗透调节物质的合成，从而限制水稻的生长发育，大大影响其生产量和品质。

水稻不同品种、不同时期和不同器官受盐胁迫伤害的程度不同，耐盐性也不同。在水稻种子萌发阶段，由于吸水收到高盐抑制，种子发芽不齐，发芽率降低，甚至根本不能发芽而在土内变质腐烂。种子萌发后，对盐胁迫极为敏感，会表现出芽尖枯黄、弯曲，迟迟不能绿化，直至出苗后的秧苗死亡。出苗后，水稻从异养阶段过渡到自养阶段，此时若遭遇盐害，则会发生卷叶和枯萎，叶片伸长和新生叶的形成都会受到抑制。水稻分蘖期、幼穗形成期和抽穗开花期遭受盐胁迫，其分蘖和伸长将受到抑制，无效分蘖增多，抽穗推迟，穗短粒少，籽粒不饱满，最终导致产量下降。

水稻对盐胁迫的应答适应和耐盐性是近年来研究的一个重点和难点。耐盐性是水稻能在高盐基质上生长，并忍耐或抵抗盐胁迫并完成整个生命周期的能力。水稻的耐盐性是多个生理过程综合作用的表现，深入开展水稻对盐胁迫的适应和耐盐性的研究，对培育耐盐水稻品种，进一步扩大水稻的可种植面积，保证粮食的安全生产和品质具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种通过抑制ossdm基因表达提高水稻耐盐性的方法。

本发明提供了一种培育抗非生物胁迫的植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达，从而使植物对非生物胁迫的耐逆性增强。

“抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过基因编辑实现的。

“抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过crispr/cas9系统实现的。所述crispr/cas9系统中的sgrna的靶序列如序列表的序列6所示。所述crispr/cas9系统中的sgrna如序列表的序列5所示。

“抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过导入重组质粒实现的；所述重组质粒表达cas9蛋白基因和特异sgrna基因；所述特异sgrna的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgrna如序列表的序列5所示。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入表达cas9蛋白基因的dna分子和表达特异sgrna基因的dna分子，得到对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物。表达cas9蛋白基因的dna分子和表达特异sgrna基因的dna分子可存在于同一质粒中也可存在于不同质粒中。所述特异sgrna的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgrna如序列表的序列5所示。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入特异质粒，得到对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物；所述特异质粒表达cas9蛋白基因和特异sgrna基因；所述特异sgrna的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgrna如序列表的序列5所示。

本发明还保护用于抑制甲基转移酶基因表达的物质在培育对非生物胁迫的耐逆性增强的植物中的应用。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为通过基因编辑抑制甲基转移酶基因表达的物质。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为通过crispr/cas9系统抑制甲基转移酶基因表达的物质。所述crispr/cas9系统中的sgrna的靶序列如序列表的序列6所示。所述crispr/cas9系统中的sgrna如序列表的序列5所示。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为表达cas9蛋白基因的dna分子和表达特异sgrna基因的dna分子。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为特异质粒；所述特异质粒表达cas9蛋白基因和特异sgrna基因。所述特异sgrna的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgrna如序列表的序列5所示。

本发明还保护一种培育对非生物胁迫的耐逆性增强的植物的方法，包括如下步骤：降低植物中甲基转移酶的含量和/或抑制植物中甲基转移酶的活性，从而使植物对非生物胁迫的耐逆性增强。

本发明还保护一种sgrna,其靶序列如序列表的序列6所示。所述sgrna如序列表的序列5所示。

本发明还保护所述sgrna在制备对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物中的应用。本发明还保护所述sgrna的编码基因和cas9蛋白的编码基因在制备对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物中的应用。

以上任一所述甲基转移酶为sdm蛋白。

以上任一所述甲基转移酶为ossdm蛋白。

所述ossdm蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(a3)来源于水稻且与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

所述甲基转移酶基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)编码区如序列表的序列2所示的dna分子；

(b2)序列表的序列3所示的dna分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的dna分子杂交且编码所述甲基转移酶的dna分子；

(b4)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述甲基转移酶的dna分子。

术语“同一性”指与天然核苷酸序列或氨基酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的一致性。

以上任一所述植物为禾本科植物。

以上任一所述植物为水稻。

以上任一所述植物为粳稻，

以上任一所述植物为水稻日本晴。

以上任一所述非生物胁迫为盐胁迫。

本发明对于以培育耐逆植物为目的的植物育种，特别是以培育耐盐水稻为目的的水稻育种，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为重组质粒pcrispr-ossdm的元件示意图。

图2为ossdm-1单株和ossdm-2单株中靶序列及其周边序列。

图3为耐盐性鉴定中的照片。

图4为耐盐性鉴定中的存活率结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻品种日本晴简称日本晴，用nip表示。

crispr/cas载体：杭州百格生物技术有限公司，产品目录号bgk03。

n6d2培养基：含300mg/l水解酪蛋白、500mg/l脯氨酸、500mg/l谷氨酰胺、30g/l蔗糖和2mg/l2,4-d的固体ms培养基。

n6d2s1培养基：含25mg/l潮霉素和600mg/l头孢霉素的n6d2培养基。

n6d2s2培养基：含50mg/l潮霉素和300mg/l头孢霉素的n6d2培养基。

分化培养基a：含300mg/l水解酪蛋白、50mg/l潮霉素、1mg/l6-ba、0.5mg/lkt、0.2mg/lzt、0.25mg/lnaa、30g/l蔗糖和30g/l山梨醇的n6d2培养基。

分化培养基b：含300mg/l水解酪蛋白、50mg/l潮霉素、1mg/l6-ba、0.5mg/lkt、0.2mg/lzt、0.5mg/lnaa、30/l蔗糖和20g/l山梨醇的n6d2培养基。

生根壮苗培养基：含1mg/l多效唑和0.5mg/lnaa的固体1/2ms培养基。

木村b培养液的配方见表1，ph值为5.8，溶剂为水。

表1

水稻日本晴中的ossdm蛋白如序列表的序列1所示。水稻日本晴的cdna中编码ossdm蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示。水稻日本晴的基因组dna中编码ossdm蛋白的基因如序列表的序列3所示。

实施例、通过cas9技术抑制ossdm基因从而增强水稻耐逆性

一、重组质粒的构建

1、合成单链dna分子ⅰ和单链dna分子ⅱ。

单链dna分子ⅰ：5’-tgtgtgatcatctcaagtaactgga-3’；

单链dna分子ⅱ：5’-aaactccagttacttgagatgatca-3’。

2、将单链dna分子ⅰ和单链dna分子ⅱ进行退火，得到具有粘末端的双链dna分子。

3、取步骤2得到的双链dna分子，与crispr/cas载体连接，得到重组质粒pcrispr-ossdm。

根据测序结果，对重组质粒pcrispr-ossdm进行结构描述如下：具有序列表的序列4所示的dna分子，表达序列表的序列5所示的sgrna。重组质粒pcrispr-ossdm的元件示意图见图1。sgrna的靶序列为(序列表的序列6)：tccagttacttgagatgat。

二、制备转基因植株

1、将重组质粒pcrispr-ossdm导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌的菌液，对日本晴的愈伤组织进行共培养浸染，然后用含300mg/l头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，然后无菌滤纸吸干，然后转移至n6d2s1培养基上，培养2周。

3、完成步骤2后，取愈伤组织，转移到n6d2s2培养基上培养2周，然后转移到新的n6d2s2培养基上培养2周。

4、完成步骤3后，取生长旺盛的愈伤组织，转移到分化培养基a上培养7d，然后转移到分化培养基b上培养至长出再生苗。培养条件：12小时光照/12小时黑暗；光照强度为8000lux；光照时温度为28℃，黑暗时温度为25℃。

5、完成步骤4后，将再生苗转移到生根壮苗培养基上进行培养，待小苗长至10cm左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3d，然后将小苗移入人工气候室栽培。

6、取步骤5得到的再生植株的叶片，进行ossdm基因突变的检测。

(1)提取叶片的基因组dna。

(2)以步骤(1)得到的基因组dna为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，pcr扩增产物进行测序。

f1：tttgacctaactttgctcttctg；

r1：gcaagattacagccaggaaag。

从再生植株中筛选到两个ossdm基因中发生突变的单株，ossdm-1单株和ossdm-2单株。ossdm-1单株和ossdm-2单株中，靶序列及其周边序列如图2所示。ossdm-1单株中，两条染色体中ossdm基因发生突变的形式不同，一条染色体缺失了2个核苷酸，另一条染色体缺失了4个核苷酸。ossdm-2单株中，两条染色体中ossdm基因发生突变的形式相同，均缺失了4个核苷酸。ossdm-1单株和ossdm-2单株中，均发生了移码从而引起了基因提前终止。

ossdm-1单株自交并收获种子，即为t1代种子，t1代种子长成的植株为t1代植株。从t1代植株中筛选纯合型植株(取叶片，提取基因组dna，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，pcr扩增产物进行测序；选择如下植株：两条染色体突变的形式相同，均缺失了2个核苷酸)，命名为ossdm-1突变体。ossdm-1突变体自交并收获种子，即为t2代种子。

ossdm-2单株自交并收获种子，即为t1代种子，t1代种子长成的植株为t1代植株。t1代植株自交并收获种子，即为t2代种子。

三、耐盐性鉴定

供试种子：ossdm-1突变体的t2代种子、ossdm-2单株的t2代种子、日本晴的种子。

进行三次重复试验，每次试验的步骤如下：

1、取供试种子24粒，装于牛皮纸袋中，28℃～30℃浸种48h。

2、完成步骤1后，28℃～30℃催芽24h(催芽过程中需保持种子湿润)，获得已催芽的种子。

3、完成步骤2后，取96孔板，每孔剪去部分下缘，然后每孔放入1粒已催芽的种子(胚芽向上、胚根向下)。

4、完成步骤3后，将所述96孔板(其上有已催芽的种子)置于盛有木村b培养液的塑料盒中并使已催芽的种子浸于培养液，光暗交替培养约3周，至幼苗生长至三叶期。每隔7d更换新的木村b培养液。

5、完成步骤4后，将所述96孔板(其上有生长至三叶期的水稻幼苗)置于盛有含200mmnacl的木村b培养液的塑料盒中并使根部完全浸于培养液，光暗交替培养10d。每隔2d更换新的含200mmnacl的木村b培养液。

6、完成步骤5后，将所述96孔板(其上有水稻幼苗)置于盛有木村b培养液的塑料盒中并使根部完全浸于培养液，光暗交替培养14d。每隔7d更换新的木村b培养液。

光暗交替培养的参数：16h光照/8h黑暗，温度30℃，光照强度10000μmol/m²/s。

观察水稻幼苗的生长状态。完成步骤4后拍照，作为处理前照片。完成步骤6后拍照，作为处理后照片。照片见图3。

完成步骤6后统计存活率。存活率＝存活的水稻幼苗数/24×100％。结果见图4。

盐胁迫前，各个水稻幼苗的生长状态无显著差异。高盐胁迫后,日本晴的叶片大多数变黄并且干枯(存活率为15％)，ossdm-1突变体的t2代种子长成的幼苗可以恢复正常生长(存活率为76％)，ossdm-2单株的t2代种子长成的幼苗可以恢复正常生长(存活率为62％)。结果表明，通过cas9技术抑制ossdm基因表达后，植株的耐盐性得到了显著的提高。

sequencelisting

<110>中国科学院植物研究所

<120>一种通过抑制ossdm基因表达提高水稻耐盐性的方法

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