不同位点白血病MEF2D-BCL9融合基因寡核苷酸的检测方法及检测试剂盒与流程

本发明属于生命科学和生物技术领域，具体涉及一种检测不同位点白血病mef2d-bcl9融合基因检测试剂盒。

背景技术：

融合基因的检测对于白血病的治疗具有重要意义，可通过对于融合基因的检测对于白血病的预后及复发进行更为准确的判断，并且随着靶向药物的逐渐问世，进行融合基因的检测可对病人实施更为精准和个体化的治疗。但是，现在还有高达30％的融合基因仍然是未知的。

mef2d-bcl9融合基因是由均位于1q21-22的肌细胞增强因子2d(myocyteenhancerfactor2d，mef2d)和b淋巴细胞瘤-9基因(b-celllymphoma-9，bcl9)易位产生，易位主要涉及mef2d的外显子5或6与bcl9的外显子9或10框内融合。mef2d编码一种普遍表达的转录因子，在多种细胞的分化过程中发挥重要作用，包括造血细胞、肌细胞、神经元等的分化过程。mef2d的失活可导致在b细胞前阶段的b淋巴细胞分化停滞。bcl9是wnt/β-catenin信号级联的组成部分，其在发育，干细胞自我更新和肿瘤发生中具有重要作用。

表1mef2dbcl9融合基因

mef2d-bcl9与人类急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，all)的发生密切相关。mef2d-bcl9重排仅涉及bcl9外显子中的最后一个或两个，导致介导与pygo1和β-catenin相互作用的bcl9结构域的缺失，导致wnt/β-catenin信号传导缺乏富集。此外，所有病例检测的该融合基因都保留了mef2d中介导dna结合和潜在的二聚化的mads-box结构域，因此，mef2d转录激活介导的异常功能可能是白血病发生的中心环节，表明mef2d功能的失调可能部分介导白血病发生。

mef2d-bcl9可用于白血病的早期检测，因为该融合基因在其他突变或复发遗传事件不存在时即可检测。携带mef2d-bcl9融合基因的患者在all队列中具有独特的特征，包括年龄较大，模拟成熟b细胞白血病的白血病细胞形态和不同的表达谱。mef2d-bcl9被鉴定为预后不良的标志物，需要更强化和更早的治疗。体外实验表明，携带mef2d-bcl9融合基因的白血病细胞对几种分子靶向药物如伏立诺他和硼替佐米均有敏感性，根据该融合基因可为患者提供更为精准的治疗方案。

实时荧光pcr综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在封闭状态下的pcr反应管中进行，其结果用ct值表示，与普通pcr比较，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，被认为是目前微量融合基因检测的首选方法。实时荧光pcr中常见的方法有sybrgreeni染料法，双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性，而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本试剂盒采用实时荧光pcr结合taqman探针检测不同位点mef2d-bcl9融合基因。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针、阳性对照，采用实时荧光pcr技术，检测内参基因abl1、不同位点mef2d-bcl9融合基因的表达情况。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及pcr反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

本发明一个方面提供了一种用于不同位点mef2d-bcl9融合基因的检验试剂盒，所述试剂盒中包括检测用引物、探针，阳性对照，其特征在于：

检测目的基因用上下游引物分别为：202-968-f、202-968-r、221-968-f、221-968-r、202-1055-f、202-1055-r、221-1055-f、221-1055-r，探针为202-968-probe、221-968-probe、202-1055-probe、221-1055-probe，检测内参基因abl1用引物为abl1-f、abl1-r，探针为abl1-probe；其中，

序列信息

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在本发明的技术方案中，所述的不同位点mef2d-bcl9融合基因为mef2d-bcl9variant1，mef2d-bcl9variant2，mef2d-bcl9variant3，mef2d-bcl9variant4，其中mef2d-bcl9variant1为位于mef2d基因的202位和位于bcl-9基因的968位发生融合的分型，mef2d-bcl9variant2为位于mef2d基因的221位和位于bcl-9基因的968位发生融合的分型，mef2d-bcl9variant3为位于mef2d基因的202位和位于bcl-9基因的1055位发生融合的分型，mef2d-bcl9variant4为位于mef2d基因的221位和位于bcl-9基因的1055位发生融合的分型。

进一步地，所述检验试剂盒中还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照品为含有mef2d-bcl9variant1，mef2d-bcl9variant2，mef2d-bcl9variant3，mef2d-bcl9variant4的融合基因质粒(融合基因片段正向克隆于pgsi载体的smai位点合成)；所述阴性对照品为去离子水。

本发明另一个方面提供了一种用于不同位点mef2d-bcl9融合基因的引物和探针组合物，所述的引物和探针组合物包括：202-968-f、202-968-r、221-968-f、221-968-r、202-1055-f、202-1055-r、221-1055-f、221-1055-r，探针为202-968-probe、221-968-probe、202-1055-probe、221-1055-probe，检测内参基因abl1用引物为abl1-f、abl1-r，探针为abl1-probe；其中，

序列信息

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本发明另一个方面公开了本发明所述的融合基因的引物和探针组合物在制备检测不同位点mef2d-bcl9融合基因试剂盒中的用途。

在本发明的技术方案中，所述的引物、荧光探针为混合物，其中202-968-f、202-968-r、221-968-f、221-968-r、202-1055-f、202-1055-r、221-1055-f、221-1055-r，以及202-968-probe、221-968-probe、202-1055-probe、221-1055-probe为混合物。

在本发明的技术方案中，202-968-f、202-968-r以及202-968-probe为混合物1，221-968-f、221-968-r以及221-968-probe为混合物2，202-1055-f、202-1055-r以及202-1055-probe为混合物3，221-1055-f、221-1055-r以及221-1055-probe为混合物4，且混合物1-4独立设置。

本发明采用实时荧光pcr技术结合tapman探针，检测受测者体内不同位点mef2d-bcl9融合基因和内参基因abl1的表达情况，对于白血病诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

本发明另一个方面提供了筛查及鉴定不同位点mef2d-bcl9融合基因的方法，其包括以下步骤：

(1)抽提骨髓中的rna；

(2)将rna反转为cdna；

(3)采用本发明所述的引物和探针组合物，或者采用本发明所述的试剂盒通过pcr反应进行检测；

(4)加样；

(5)检测。

优选地，所述的筛查及鉴定不同位点mef2d-bcl9融合基因的方法为非诊断和治疗目的的。

进一步地，pcr反应的条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；反应40个循环，荧光信号于72℃15s时采集。

有益效果：

敏感度高：可检测低至10copies/μl融合基因。

特异性强：使用特异性探针识别融合基因序列，准确性高，同时使用探针和引物双重控制，特异性好且假阳性低。全程监控：实时监测全程扩增信号，引入内参、阳性对照和阴性对照有效保证样本质量，降低假阴性和假阳性。

安全简便：操作简单安全，自动化程度高而且防止污染。快速：快速而且高通量，完成检测时间为98min

附图说明

图1为使用本发明所述核酸检测试剂盒检测mef2d-bcl9variant1(202-968)的结果图例。

图2为使用本发明所述核酸检测试剂盒检测mef2d-bcl9variant2(221-968)的结果图例。

图3为使用本发明所述核酸检测试剂盒检测mef2d-bcl9variant3(202-1055)的结果图例。

图4为使用本发明所述核酸检测试剂盒检测mef2d-bcl9variant4(221-1055)的结果图例。

具体实施方式

为本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步具体说明。

实施例1试剂盒的制备

1.特异性的引物和探针的设计

根据基因序列(abl1基因序列、mef2d-bcl9基因序列以及其伙伴基因序列均来自于美国国家生物技术信息中心核酸数据库)设计特异性探针和引物。

abl1基因id：25，基因参考序列nm_005157.6；

mef2d基因id：4209，基因参考序：nm_001271629.1；

bcl9基因id：607，基因参考序：nm_004326.4。

2.试剂盒组分配制

引物和探针：包括检测不同位点mef2d-bcl9融合基因和内参abl1引物以及与引物相对应的探针，具体如下：

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阳性对照品：含不同位点mef2d-bcl9融合基因质粒；阴性对照品：去离子水。

实施例2本试剂盒的操作流程

1.抽提骨髓中的总rna:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取骨髓0.5ml混匀。室温避光静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，冰上静置15min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀，冰上静置10min后12000rpm离心15min；吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，冰上静置10min后4℃12000rpm离心15min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；7500rpm4℃离心10min；弃去上清，重复上一步骤；弃去上清，室温干燥10-15min，加入10-20μldepc水溶解沉淀。

2.参考takara公司的primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒说明书，将rna反转为cdna。

3.试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，x＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)每人份18μl分装，每18μl组成如下：

4.加样：加入检测体系pcr反应液中2μlcdna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μlrnase-freedh2o。

5.检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括bioradcfx96,abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；反应40个循环，荧光信号于72℃15s时采集。

6.结果判断：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

实施例3检测白血病标本以及临床体检标本

1.取送检的b-all白血病患者骨髓标本共14例，按实施例2所述方法提取基因组rna、配制试剂并检测。每份标本加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性、阴性、空白对照，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为98分钟。在内参、阳性对照、阴性对照以及空白对照均正常的情况下，由于mef2d-bcl9融合基因在白血病患者当中较为罕见，14例白血病样本均为阴性结果，即这14例患者中均不属于存在mef2d-bcl9融合基因的分型，结果如下表：

综上结果表明，本试剂盒可高通量、快速、准确地检测样本，同时具有良好的特异性和可重复性，可有效避免假阳性和假阴性结果。

sequencelisting

<110>南方医科大学

<120>不同位点白血病mef2d-bcl9融合基因寡核苷酸的检测方法及检测试剂盒

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