一种引物探针组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种引物探针组合物及其应用。

背景技术：

卵巢透明细胞癌(ovarianclearcellcarcinoma，occc)是上皮卵巢癌的四个主要组织学亚组之一：即浆液性、透明细胞、子宫内膜样和粘液性。occc具有明显的特征，如化疗耐药、预后不良，与子宫内膜异位症相关，血栓形成的并发症发生率较高，亚洲人发病率较高。occc由于各种肿瘤抑制因子和癌基因的突变而发展，包括arid1a、pik3ca、kras和tp53等。

肿瘤组织将cfdna释放到血液中，其中一些dna含有诊断癌症的体细胞突变。cfdna平均长度为140-170bp，每毫升血液仅存在几千个可扩增拷贝。聚合酶链反应(pcr)和新一代测序(ngs)技术的最新进展使得通过测量少量的cfdna，从而检测肿瘤组织特征性的体细胞突变成为可能，例如pik3ca-h1047r，-e545k和-e542k(乳腺癌)、braf-v600e和-v600k以及nras-q61h(黑素瘤)、egfr-t790m(非小细胞肺癌)。因此，越来越多的证据表明，cfdna可用于肿瘤的早期诊断、疗效监测、复发监测以及预后判断等。

ca125(癌胚抗原125)是可用于occc的一种肿瘤生物标志物。与正常健康人群相比，occc患者体内的ca125表达水平显著升高。pik3ca在大约50％的occc患者中发生突变，并且pik3cah1047r是突变热点，可用一对引物进行检测。在携带kras突变的occc患者中，大约4％的患者携带的是krasg12d突变，也可用一对引物进行检测。尽管arid1a基因是occc中突变频率最高的基因，大约为60％，但是检测arid1a基因的突变需要多对引物，比较复杂。

微滴式数字pcr(ddpcr)作为新一代数字pcr检测系统，具备绝对定量、高灵敏度、高特异性、重复性好以及抗干扰能力强等优点。在肿瘤相关领域，数字pcr已经被用于肺癌患者的液态活检，以辅助指导靶向药物的使用；亦可用于结直肠癌患者，高灵敏度的检测系统能够从外周血中发现耐药突变，且外周血与组织的一致性高。较之肺癌和结直肠癌，数字pcr在其他癌症尤其是卵巢透明细胞癌中的相关报道较少。

现有技术往往针对含有基因突变的cfdna直接进行检测，灵敏度较低。因此，提供一种基于ddpcr平台的检测体系，提高检测灵敏度，提早给予患者预警，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种引物探针组合物及其应用，基于ddpcr平台进行开发，针对特异性检测位点设计引物和探针，优化检测体系和条件，实现准确稳定的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种引物探针组合物，所述组合物包括pik3cah1047r的巢式引物和pik3cah1047r的双标记锁核酸探针；

其中，所述巢式引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，所述双标记锁核酸探针的核苷酸序列如seqidno.3-4所示。

所述巢式引物包括上游引物和下游引物。

上游引物的核苷酸序列为seqidno.1：5’-actgagcaagaggctttgga-3’；

下游引物的核苷酸序列为seqidno.2：5’-gcatgctgtttaattgtgtgg-3’.

seqidno.3为ccatgacgtgca.

seqidno.4为ccatgatgtgca.

所述双标记锁核酸探针包括突变型探针和野生型探针；

优选地，所述野生型探针和突变型探针的5’端标记有不同的荧光基团，所述荧光基团包括fam、hex、cy3或cy5中的任意两种的组合。

优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’端标记有淬灭基团，所述淬灭基团包括bhq、tamra或ibfq中的任意一种。

突变型探针为5’-famc+catg+a+c+gtgca-iowablackfq-3’；

野生型探针为5’-hexc+catg+a+t+gtg+ca-iowablackfq-3’.

加号表示间隔，在探针合成时提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用。

本发明中，发明人为解决现有技术存在的难点，例如：由于cfdna浓度低而无法准确检测到基因突变，或者检测灵敏度低，不利于尽早发现疾病复发；在长期科研实践过程中，基于ddpcr平台和卵巢透明细胞癌突变位点pik3cah1047r设计引物探针组合物，实现了激活突变的有效检测，结果准确性好，稳定性和灵敏度高。

锁核酸(lockednucleicacid,lna)是一种新颖的核苷酸衍生物，锁核酸探针具有两个明显的优点，一是可增强热稳定性和杂交的特异性，二是lna探针长度较短，可增加设计的灵活性。碱基锁定的lna探针极大地提高了探针的tm值和特异性。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合物用于制备卵巢透明细胞癌检测试剂盒的应用。

第三方面，本发明提供一种卵巢透明细胞癌检测试剂盒，所述检测体系包括第一方面所述的引物探针组合物。

优选地，所述试剂盒还包括缓冲液、dna聚合酶、dntp和特异性切割pik3ca野生型的crispr/cas9试剂。

优选地，所述缓冲液包括kcl、tris-hcl或mgcl2中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述试剂盒包括dntp、0.2udna聚合酶、10×buffer(500mmkcl、100mmtris-hcl(ph8.3)、15mmmgcl2)。

优选地，所述试剂盒的反应混合物体系为20μl，包括2.5ng或5ng消化的样本dna、探针ddpcr超级混合物、每条引物800-1200nm、每个探针230-270nm，采用ddpcr平台(包括伯乐qx100微滴生成仪、伯乐t100热循环仪、伯乐qx100微滴读取仪)进行检测。

本发明为了提高ddpcr检测含有pik3cah1047r的cfdna的灵敏度，将cfdna进行预扩增，而后采用crispr/cas9系统特异性切割含有野生型pik3ca的cfdna，产物纯化后进行ddpcr。根据微滴读取仪的结果可知，cfdna预扩增后切割再进行ddpcr的检测灵敏度显著提高。

一般而言，血液中的血浆游离dna的浓度较低，携带致病或疑似致病突变的循环肿瘤dna的浓度往往更低，为了提高ddpcr检测含有pik3cah1047r的cfdna的灵敏度，发明人采用简单可行的crispr/cas9系统切割野生型片段，去除背景和干扰。

预扩增时的模板是肿瘤样本直接提取的cfdna，里面既有野生型也有突变型，不会只有突变型；特异单导rna仅识别野生型，而野生型pik3ca的靶标序列为seqidno.5：5’-caaatgaatgatgcacatca-3’。

第四方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包括第一方面所述的引物探针组合物。

优选地，所述检测体系包括crispr/cas9系统切割野生型pik3ca单元、巢式pcr预扩增单元和ddpcr单元。

优选地，所述crispr/cas9系统切割野生型pik3ca单元包括含有野生型pik3ca的cfdna、cas9和野生型pik3ca特异的单导rna。

优选地，所述巢式pcr预扩增单元包括如第一方面所述的引物探针组合物中的巢式引物、cfdna、缓冲液和氯仿；

优选地，所述巢式pcr预扩增单元的巢式引物的浓度为8-12μm。

优选地，所述巢式引物的浓度为8-12μm，例如可以是8μm、9μm、10μm、11μm或12μm。

优选地，所述cfdna的添加量为2.5ng或5ng。

优选地，所述缓冲液为10×pcrbuffer(500mmkcl、100mmtris-hcl(ph8.3)、15mmmgcl2)；

优选地，所述巢式pcr预扩增单元还包括0.2udna聚合酶、2×ddpcr超级混合物、氯仿(国药，分析纯)、tebuffer(10mmol/ltris-hcl，ph8.0、1mmol/ledta，ph8.0)。；

正向引物序列seqidno.1：5’-actgagcaagaggctttgga-3’；

反向引物序列seqidno.2：5’-gcatgctgtttaattgtgtgg-3’

优选地，所述巢式pcr预扩增单元的反应条件为：95℃10min；95℃30sec，60℃60sec，9个循环；98℃10min。

优选地，所述ddpcr单元包括第一方面所述的引物探针组合物和crispr/cas9系统切割野生型pik3ca单元的产物；优选地，所述ddpcr单元的巢式引物的浓度为800-1200nm，例如可以是800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm。

优选地，所述双标记锁核酸探针的浓度为230-270nm，例如可以是230nm、240nm、250nm、260nm或270nm。

优选地，所述巢式pcr预扩增单元的产物的浓度为2.5-7.5ng/μl，例如2.5ng/μl、5ng/μl或7.5ng/μl。

优选地，使用lna探针和pik3ca-h1047r的引物通过ddpcr重新扩增纯化后的剪切产物，ddpcr的反应条件：95℃10min；95℃30sec，60℃60sec，40个循环；98℃10min。

由于occc的发生发展与多个基因的变异，而其主要作用的基因突变位点却相对较少，检测关键的位点突变可进行有效的早期诊断、疗效监测、复发监测以及预后判断等临床行为；本发明通过借鉴前人的研究结果并结合自身的临床实践，在多个基因多个位点中选择pik3cah1047r进行检测，并采用ddpcr平台进行检测，从而为occc患者提供可靠的疗效监测和复发监测的可能性。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明分别以未扩增的cfdna和扩增的cfdna为模板进行ddpcr，检测得到的突变等位基因的频率有显著差异，因此，cfdna预扩增后进行crispr/cas9切割的操作有利于提高检测灵敏度；

(2)本发明提供的引物探针组合物设计合理，检测灵敏度高，准确稳定，相关度好，检测体系简洁高效，各条件相互配合，能够共同实现精准检测。

附图说明

图1为本发明的肿瘤样本1-4和健康样本的pik3ca-h1047r检测结果；

图2为本发明的肿瘤样本5和健康样本的pik3ca-h1047r检测结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1制备试剂盒

将引物探针组合物、缓冲液、氯仿和特异性切割pik3ca野生型的crispr/cas9试剂和说明书组装成试剂盒。

所述巢式引物包括上游引物和下游引物。

上游引物的核苷酸序列为seqidno.1：

5’-actgagcaagaggctttgga-3’；

下游引物的核苷酸序列为seqidno.2：

5’-gcatgctgtttaattgtgtgg-3’。

突变型探针为5’-famc+catg+a+c+gtgca-iowablackfq-3’；

野生型探针为5’-hexc+catg+a+t+gtg+ca-iowablackfq-3’。

实施例2

1、dna提取

采用edta采血管收集血液，并采用试剂盒提取dna，并检测dna的纯度和浓度；所用试剂盒分别为qiaampcirculatingnucleicacidkit(qiagen)和qubit2.0highsensitivitydnakit(thermofisher)。

2、巢式pcr进行预扩增

以cfdna为模板，对于pik3ca包含第1047位密码子的一个107bp的片段进行ddpcr扩增，反应体系为20μl，包含样本cfdna2.5ng、缓冲液和引物等，引物浓度为10μm。

上游引物seqidno.1为5’-actgagcaagaggctttgga-3’；

下游引物seqidno.2为5’-gcatgctgtttaattgtgtgg-3’。

反应程序见表1；

表1

加入氯仿和te缓冲液，涡漩，取上清，纯化。

在纯化产物中加入lan探针和pik3cah1047r引物，重新进行ddpcr扩增；纯化并剪切后再ddpcr是一部分，即图例中的“预扩增并切割”；纯化后直接进行ddpcr是另一部分，即图例中的“预扩增”。

3、在体外切割cfdna中的野生型pik3ca

将cfdna预扩增后，采用guide-itcompletesgrnascreeningsystem(takarabio)进行野生型pik3ca的切割，即加入cas9、单导rna(sgrna)一起孵育。

4、ddpcr

(1)pik3cah1047r的检测采用双标记lan(锁核酸)探针策略，

突变型探针为5’-famc+catg+a+c+gtgca-iowablackfq-3’；

野生型探针为5’-hexc+catg+a+t+gtg+ca-iowablackfq-3’。

(2)反应体系：反应体积为20μl，包含2.5ng或5ng的样本dna，引物均为1000nm，探针均为250nm。

(3)反应程序见表2；

表2

实施例3

为了对比切割野生型pik3ca能够提高检测灵敏度，本实施例首先分为两组，即cfdna未扩增组和cfdna预扩增组；

针对预扩增的cfdna，一部分预扩增产物纯化后用于直接ddpcr，另一部分预扩增产物用于切割野生型pik3ca，因此步骤3和步骤4为并列关系。

1、提取dna；

2、应用巢式pcr进行预扩增，巢式pcr预扩增单元包括如第一方面所述的引物探针组合物中的巢式引物(10μm，正向引物序列：5’-actgagcaagaggctttgga-3’和反向引物序列：5’-gcatgctgtttaattgtgtgg-3’)、cfdna(2.5ng)、缓冲液(10×buffer，0.2udna聚合酶，2×ddpcr超级混合物)；1000nm是将cfdna直接进行ddpcr时所采用的引物浓度，即图中的“未扩增”；而10μm是预扩增时采用的引物浓度。

3、利用minelute(qiagen)试剂盒进行预扩增产物纯化；加入200μl氯仿和80μlte缓冲液，涡旋1分钟，充分萃取巢式pcr预扩增产物，然后以10,000×g离心10分钟，取出上清液，使用minelute(qiagen)纯化。

4、野生型pik3ca的切割：首先，将预扩增纯化产物、cas9蛋白、单导rna(sgrna)同时加入反应缓冲液中，进行孵育。孵育条件为：37℃孵育1小时，70℃孵育10分钟，终止反应，然后，使用minelute(qiagen)纯化反应产物；sgrna设计时根据野生型pik3ca靶标序列5’-caaatgaatgatgcacatca-3’，记作seqidno.5。

5、以纯化产物为模板，加入pik3ca-h1047r锁核酸探针和引物等进行ddpcr，引物均为1000nm，探针均为250nm。

根据微滴读取仪的结果可知，三种实验操作(cfdna直接进行ddpcr、cfdna预扩增后进行ddpcr、cfdna预扩增后切割再进行ddpcr)的结果差异显著，其中cfdna预扩增后切割再进行ddpcr的检测灵敏度最高。pik3ca-h1047r检测结果见图1和图2，＊表示p<0.05(t测验)。

综上所述，本发明提供一种引物探针组合物及其应用，基于ddpcr平台进行开发，针对特异性检测位点设计引物和探针，优化检测体系和条件，实现准确稳定的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110>天津脉络医学检验有限公司

<120>一种引物探针组合物及其应用

<130>2019年

<141>2019-02-20

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

actgagcaagaggctttgga20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工合成()

<400>2

gcatgctgtttaattgtgtgg21

<210>3

<211>12

<212>dna

<213>人工合成()

<400>3

ccatgacgtgca12

<210>4

<211>12

<212>dna

<213>人工合成()

<400>4

ccatgatgtgca12

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>5

caaatgaatgatgcacatca20