一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用rna干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用dna片段。

背景技术：

真核细胞摄入dsrna（双链rna），会引起细胞内源同源mrna的降解，从而造成对应基因表达受阻，这种现象被称之为rna干扰（rnainterference,rnai）。植物介导的rnai技术是通过转基因技术，把表达昆虫基因的dsrna（或者hprna，即发夹结构rna）的基因表达盒导入到植物中，害虫取食这种含害虫基因dsrna/hprna植物材料后，摄入的dsrna/hprna会引起害虫的rnai，有可能会起到抑制昆虫生长发育甚至杀死害虫的作用，从而达到保护植物的目的。

2007年，maoyb等在棉花中表达与棉酚解毒代谢直接相关p450基因（cyp6ae14）的dsrna，饲喂棉铃虫后，cyp6ae14基因的表达水平显著降低，同时棉铃虫对棉酚的耐受性减弱，提高了棉酚对棉铃虫的毒性【非专利文献：maoyb,caiwj,wangjw,etal.silencingacottonbollwormp450monooxygenasegenebyplant-mediatedrnaiimpairslarvaltoleranceofgossypol.natbiotechnol,2007,25(11):1307-1313.】。同年，baum等先通过饲喂dsrna试验从玉米根萤叶甲的290个候选靶标基因筛选出液泡atp酶基因（vacuolaratpase,v-atpase），然后将其转入玉米使转基因植株表达dsrna，结果表明在防治玉米根萤叶甲有很好的效果【非专利文献：baumja,bogaertt,clintonwetal.controlofcoleopteraninsectpeststhroughrnainterference.natbiotechnol,2007,25:1322-1326.】。上述奠基性工作开创了植物抗虫基因工程研究领域的一个热点。

植物介导的rnai技术具有抗虫基因来源广、基因特异性强、残留低等优点。然而正是由于基因来源广泛，寻求合适的靶标基因成为该技术的关键点和难点。

几丁质脱乙酰基酶（chitindeacetylase，cda）参与昆虫几丁质的降解与修饰，催化几丁质转化为壳聚糖（其中的n-乙酰基葡糖胺的乙酰基的水解）。cda的对昆虫生长发育的重要作用已经得到证实。

2005年guo等首次在粉纹夜蛾中肠cdna文库中分离到cda的cdna序列，此基因编码的蛋白质能与几丁质相互结合，提出该蛋白的功能可能与围食膜的形成及更新有关。此后，在多种昆虫上进行了cda编码基因的分子克隆及其表达分析研究。

昆虫cda分为五类（group）。第1类和第2类含三个结构域：几丁质结合围食膜a结构域（chitinbindingperitrophin-adomain，chbd），低密度脂蛋白a类受体结构域（low-densitylipoproteinreceptorclassadomain，ldla）和多糖脱乙酰基酶催化结构域（polysaccharidedeacetylasecatalyticdomain，cda）；第3类和第4类都没有ldla结构域、有cda与chbd结构域，但二者结构域的位置存在较大差异；第5类cda只具有cda结构域。在此基础上，可将第1类进一步分成两个亚组（ia、ib），还发现在ib亚组存在选择性剪接。五类cda反映了昆虫cda的进化关系，并且在不同物种昆虫生长发育中发挥着重要的作用。

棉铃虫（helicoverpaarmigera）是一种重要的农业害虫，危害棉花、玉米等多种农作物。上世纪90年代棉铃虫大爆发曾给我国棉花生产带来极大损失。转基因抗虫棉及其他措施的应用使得棉花生产得以平稳发展至今。将来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白δ-内毒素编码基因（bt基因）通过转基因技术导入到农作物，使农作物能够表达杀虫蛋白以达到防治害虫的目的。除了bt基因外，一种来自于豇豆的蛋白酶抑制剂（cpti）基因也被用于我国的转基因抗虫棉品种。但是，当前转基因抗虫棉面临着抗虫性不理想、昆虫抗性进化、优良抗虫基因较单一等问题，亟待开发新的抗虫基因及方法。

发明人在棉铃虫转录组数据发掘、基因克隆以及植物介导的rnai研究中发现，棉铃虫的几丁质脱乙酰基酶5a基因可成为植物介导的rnai的理想靶标基因，目前，还没有将棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为rnai靶标基因来提高植物抗虫性的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种利用rna干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用dna片段，以解决现有转基因植物抗虫性不理想、昆虫抗性进化、优良抗虫基因较单一的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一个如式（i）所示的dna片段：

seq正向-x-seq反向（i）

其中，seq正向是棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cdna片段中的至少包括21bp的任何一段；seq反向与所述seq正向反向互补；x是seq正向与seq反向之间的间隔序列，x与所述seq正向和seq反向均不互补，且x的长度≥10bp；所述棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cdna如序列表中的序列1所示。

进一步地，所述seq正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

一种含有上述dna片段的重组载体。

所述重组载体通过如下方法构建：将序列表中序列2所示的dna片段同时以正向和反向的方式插入到prnai-gg上，从而构成植物遗传转化载体。

棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为rna干扰靶标基因在提高植物抗虫性中的应用。

一种提高植物抗虫性的方法，将上述的dna片段导入目的植物中得到转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。

进一步地，上述的dna片段是通过所述的重组载体导入目的植物中的。

进一步地，所述抗虫是指抗鳞翅目的昆虫。进一步地，所述抗虫是指抗鳞翅目昆虫的幼虫。更进一步地，所述抗虫是指抗棉铃虫的幼虫。

进一步地，所述目的植物为可以被上述昆虫所取食的植物。更进一步，所述目的植物为陆地棉。

本发明的方法具体包括以下步骤：

1、获取基因序列

通过设计合成引物，然后对棉铃虫mrna进行反转录-多聚酶链式反应（rt-pcr），或者通过化学合成，得到棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因序列（hacda5a基因，如序列表中序列1所示）。

2、靶标序列的选取及棉铃虫5a型几丁质脱乙酰基酶特异dsrna表达序列结构的设计

（1）获得上述dna序列后，选取其中的部分序列作为靶标序列，要求长度不短于21碱基对（bp），通过pcr技术扩增得到靶标序列；

（2）利用dna重组技术，将靶标序列构建成植物hprna（发卡rna）表达结构，表达结构如式（i）所示：

seq正向-x-seq反向（i）

其中，所述seq正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示，seq反向和seq正向为序列相同、方向相反的序列，x序列为长度不短于10个核苷酸对（bp）且与seq正向和seq反向均不互补的任意dna序列。

3、载体构建及植物转化

将含有上述表达结构的重组表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等成熟的植物遗传转化技术导入到目标植物中，从而提高目的植物对有关害虫的抗性。表达载体骨架可为prnai-gg，将序列表中序列2所示的dna片段同时以正向和反向的方式插入到prnai-gg上，从而构建含有上述表达结构的重组表达载体。

4、抗虫性验证试验及适用对象

本发明适用于的植物是能进行转基因操作的任意植物。常见转基因植物对象包括棉花、玉米、水稻、小麦、番茄、马铃薯、大豆、杨树等。防治对象可以是任何取食转基因植物、且能引起rnai效应的害虫。常见的害虫包括来自于鳞翅目、鞘翅目、等翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、半翅目、缨翅目等类群的植食性昆虫或农业害虫。本发明的具体流程参见图1所示。

本发明首次将棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为rna干扰靶标基因，并应用于培育抗虫性提高的转基因植物中。本发明对鳞翅目昆虫的幼虫具有较好的抗虫性，能够大大降低昆虫对植物的侵害，更具针对性。实验证明，接种到野生型烟草上的棉铃虫幼虫生长繁殖正常，而转基因烟草上的棉铃虫幼虫生长发育受到严重抑制，转接后2天到5天棉铃虫幼虫的体重小于对照组体重的1/10；将野生型与转基因烟草叶片混合喂食棉铃虫幼虫，棉铃虫对转基因烟草叶片表现出极强的拒食现象；喂食5天转基因烟草叶片上的幼虫死亡率达到68%，野生型烟草只有21%。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图，图中：①和②为靶标序列，序列相同方向相反，③为起间隔作用的内含子序列。

图2为prnai-gg-hacda5a质粒图谱。

图3为prnai-gg-hacda5a转基因烟草的pcr检测结果，图中：“+”：阳性对照；1-9：待检测植株且为卡那霉素抗性阳性植株；m：markerdl2000；n1：野生型烟草阴性对照；n2：无模板阴性对照。

图4为转基因烟草的rt-pcr检测结果，图中：“+”：阳性对照；1-11：待检测植株且为阳性植株；m：markerdl2000；n1：野生型烟草；n2：无模板。

图5为棉铃虫饲喂实验中咬噬烟草叶片的照片。

图6为饲喂野生烟草与转基因烟草棉铃虫幼虫体重变化图。

图7为连续饲喂5天野生烟草与prnai-gg-hacda5a转基因烟草后棉铃虫死亡率对比图。

图8为野生烟草与转基因烟草对比饲喂试验的照片。其中：左图为转基因（5a，下）与非转基因（wt，上）烟草叶片饲喂棉铃虫幼虫12小时的照片，右图为转基因（5a，下）与非转基因（wt，上）烟草叶片饲喂棉铃虫幼虫60小时的照片。

图9为实施例5中不同时间棉铃虫hacda5a基因的相对表达量对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法进行，本领域技术人员可参照相关技术书籍实施，如：格林、萨姆布鲁克等著《分子克隆实验指南》第4版（2017），等。

实施例1

采用rt-pcr（反转录-多聚酶链式反应）技术得到基因序列。

1、pcr引物设计

棉铃虫几丁质脱乙酰酶5a基因（hacda5a）pcr引物序列为cda5af：5'-atgaagttgttcgggcttcttg-3'，cda5ar：5'-cagttgtagatttattgtccaag-3'。

2、棉铃虫总rna提取及cdna合成及扩增

用trizol试剂提取5龄棉铃虫总rna，用反转录酶合成cdna第一链。pcr反应体系：2μl10×buffer、lμmol/l上/下游引物、0.1mmol/ldntps、1单位taq聚合酶、0.5μlcdna、用ddh2o补足至20μl。pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；最终延伸72℃，10min。

3、pcr产物回收、ta克隆及鉴定

采用硅胶柱法分别回收pcr凝胶电泳产物，然后与t载体连接。连接体系为（10μl）：1μlt载体、1μlt4dna连接酶、1μl10×t4连接酶buffer、7μl回收产物。将配制好的连接体系放置16℃进行过夜连接后，用热激法转化到大肠杆菌（dh5α）中。用引物cda5af/cda5ar对抗性菌落进行pcr鉴定，将pcr阳性克隆送生物公司测序，即可得到所述的基因序列（如序列表序列1所示）。

实施例2

1、靶标序列的制备

采用pcr技术扩增上述阳性克隆以制备靶标序列，引物序列分别为：

cdai5af:5'-accaggtctcaggagatgaagttgttcgggcttcttg-3'，

cdai5ar:5'-accaggtctcatcgttactccaagccatattcctg-3’，

引物5'端15个碱基的小写部分为goldengate克隆技术所需要的部分序列。扩增的靶基因序列大小为578bp（hacda5a，序列表中序列2所示）。

2、pcr扩增获得靶标基因片段

pcr扩增体系均为：质粒模板0.6μl，对应的上、下游引物各2.4μl，2×taqmstermix15μl，ddh2o补足30μl；pcr扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s；52℃，30s；72℃，40s，35个循环；72℃，10min。将扩增的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照凝胶回收试剂盒说明书回收符合预期大小的dna电泳条带。

实施例3

植物hprna表达载体的构建

本实施例所用的植物表达载体骨架为prnai-gg，该载体质粒上有一个hprna表达盒：camv35s起动子驱动、nos终止子终止转录；转录区有两个由内含子序列间隔开的细菌ccdb基因；每个ccdb基因序列两端各有两个bsai内切酶（iis类型）识别位点。

采用goldgate技术构建植物表达载体。将靶标序列pcr扩增产物与prnai-gg质粒置于一管中，同时加入bsai和t4dna连接酶（使用t4连接酶反应缓冲液）进行goldengate反应，反应体系为：prnai-gg质粒200ng，靶标序列pcr产物50ng，t4ligase350u（takara公司），t4ligasebuffer1μl（takara公司），bsai5u（neb公司），ddh2o补足10μl。之后经过转化、测序鉴定等步骤，可以构建成靶标序列的hprna表达载体。其中prnai-gg-hacda5a图谱如图2所示。

实施例4

植物表达载体转化烟草

1、采用农杆菌介导的烟草遗传转化技术

利用电激转化法把构建成的质粒载体导入到农杆菌lba4404感受态细胞中，以进行农杆菌介导的烟草遗传转化实验。本实施例所转化的植物为烟草，本发明的转基因对象不限于烟草。

获得烟草无菌苗：取野生型烟草种子置于1.5ml微量离心管中进行消毒处理：首先用体积分数为70%的乙醇溶液清洗30s，然后用无菌水冲洗三次，之后用浓度为10%的次氯酸钠溶液震荡清洗10min，最后用无菌水清洗五次用于培养无菌烟草植株。待无菌烟草植株叶片长至一定大小后，用刀和镊子在超净工作台中切取面积约为1cm²无菌叶片用于组织培养。

取含有prnai-gg-hacda5a质粒的农杆菌（lba4404）菌液进行活化，然后转接入体积为300ml的lb培养基上进行培养，待农杆菌od600=0.8时分装菌液进行离心，富集菌体，将其配制成一定浓度的农杆菌悬浮液用于侵染烟草叶片。经过预培养、暗培养和选择培养阶段，获得了从愈伤组织上分化形成的不定芽，将其移入生根培养基中进行生根培养，待其分化生根且叶片数量长至4-6片的时候移栽入土壤中继续培养用于抗虫试验。

2、转基因烟草的pcr检测

提取转基因烟草植株的基因组dna进行pcr检测。经过pcr鉴定，获得转hacda5a基因阳性植株9株。阳性转基因烟草基因组dna扩增条带大小与阳性质粒扩增条带大小一致，野生型烟草基因组dna和无模板阴性对照均没有出现对应大小的阳性条带。转prnai-gg-hacda5a载体烟草植株检测结果如图3所示，模板依次为阳性质粒（+）、待检测转基因烟草叶片基因组dna（1-11）、野生型烟草叶片基因组dna（n1）和无模板阴性对照（n2）。

3、转基因烟草的rt-pcr检测

取转基因烟草植株和野生型烟草植株的叶片在液氮中充分研磨，按照trizon（北京康为世纪公司）总rna提取试剂说明书提取烟草叶片总rna。进行琼脂糖凝胶（1%）电泳观察rna的质量；用核酸测定仪测定rna在260nm和280nm处的吸光值以及a260/280和a260/230的值。取两种检测方法检测均符合要求的烟草rna合成cdna第一链。以cdna第一链作为模板进行rt-pcr检测（野生型烟草cdna以及无模板体系为阴性对照），所用引物为扩增目的基因的特异性引物，以在转录水平上鉴定转基因烟草植株。转prnai-gg-hacda5a载体烟草植株检测结果如图4所示。

实施例5

1、hacda5ahprna表达植株抗虫性分析

本实施例所涉及害虫为棉铃虫，本发明防治对象不限于棉铃虫。

将转基因烟草植株种子种在含卡那霉素的ms抗性平板上，对发芽率进行统计学分析，筛出转基因单拷贝的t2代转基因烟草植株。随机选择3株长势一致、且为单拷贝插入的转基因烟草植株进行棉铃虫饲喂实验，以野生型烟草植株作为对照株系，一共分为2组（实验组和对照组）。试验中，将棉铃虫卵放于培养条件设置好的人工气候箱中进行避光孵化，待其初孵后按照上述两组不同处理进行虫试分析。

将初孵一龄棉铃虫幼虫接于人工饲料上。待生长至二龄期，选取大小接近的幼虫接于新鲜的转基因、野生型烟草叶片上进行饲喂。叶片置于玻璃培养皿中，每个培养皿接12条，实验组与对照组均分别设三组重复，一共36条。饲喂期间每天更换新鲜烟草叶片并记录棉铃虫幼虫体重变化，同时计算死亡率，饲喂结果如图5所示。实验设置三个生物学重复。实验证明，接种到野生型烟草上的棉铃虫幼虫生长繁殖正常，而转hacda5ahprna基因烟草上的棉铃虫幼虫生长发育受到严重抑制，转接后2天到5天棉铃虫幼虫的体重小于对照组体重的1/10（如图6所示）；5天后转基因烟草叶片上的幼虫死亡率达到68%，野生型烟草只有21%（如图7所示）；将野生型与转基因烟草叶片混合喂食棉铃虫幼虫，棉铃虫对转基因烟草叶片表现出极强的拒食现象（如图8所示）。

2、棉铃虫幼虫靶标基因的沉默效率检测

将初孵化的一龄期幼虫接于棉铃虫人工饲料上，待幼虫生长至二龄期的时候，选取大小相同的棉铃虫幼虫分别接种于新鲜的转基因、野生型烟草叶片上进行饲喂，每12h更换一次新鲜叶片，收集24h、48h、60h的棉铃虫幼虫，每次收集3只置于离心管中，迅速冻于-80℃冰箱中。设置三个生物学重复。

提取收集的棉铃虫幼虫的rna进行反转录获得棉铃虫的cdna第一链，具体操作步骤参照说明书。用beacondesigner软件设计引物进行荧光定量pcr实验检测饲喂转基因烟草对目的基因的沉默效率，内参基因为β-actin，采用sybrgreen法。荧光pcr引物序列：cda5aqf：5'-agaactcctcaaacctactg-3'，cda5aqr：5'-tactccaagccatattcctg-3'。棉铃虫β-actin序列：引物β-actinf：5'-ctgaccgtatgcagaaggag-3'，β-actinr：5'-cacaagcgtaatttgagcc-3'。

荧光pcr体系为：10μlsybrgreenmastermix，0.5μmol/l上/下游引物，0.5μlcdna，用ddh2o补足20μl。荧光pcr程序为：5℃预变性5min，95℃变性10s，53℃退火10s，72℃；延伸15s，45个循环。每个样品进行3个生物学重复，用无转录反应模板和无模板作阴性对照。2^-△△ct的方法分析不同的棉铃虫hacda5a基因在不同饲喂时间的相对表达量的变化，以最低表达量为1，用microsoftexcel（2007）对实验数据进行处理，spss软件对数据进行显著性分析，p＜0.05为显著性差异。靶标基因沉默最大接近55%。结果如图9所示。

对比例1

以hacda1基因为靶标基因，参照实施例1~5的操作步骤获得hacda1hprna表达植株并对其抗虫性进行研究，其中，hacda1基因的cdna合成引物为hacda1基因icd1f：5'-ggttttgttcataatgtc-3'；icd1r：5'-atcaacaacaacaacatc-3'。hacda1基因靶标序列合成引物为cdai1f：5'--accaggtctcaggagggttttgttcataatgtc-3'，

cdai1r：5'-accaggtctcatcgtatcaacaacaacaacatc-3'，所得的靶标序列如序列表序列3所示，扩增的靶基因序列大小为643bp。对最终得到的转hacda1hprna基因烟草进行棉铃虫饲喂实验，结果如图5所示。由对比效果可以看出，转基因植物的抗虫性具有不可预期性，本发明的应用hacda5a基因提高植物抗虫性的方法具有突出的抗虫效果。

sequencelisting

<110>河北大学

<120>一种利用rna干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用dna片段

<130>2-2

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1173

<212>dna

<213>hacda5a

<400>1

atgaagttgttcgggcttcttgctttgttgctggtagcttcggccttcgctgatgactct60

tcgtcttcagaagaagaaaatgagggcctgcctttggcagaggcctgtgaccaggaagct120

tgcagcttgcctgactgcggatgttccagcaccaacattcccggaggattgaacccacga180

gatataccacagttcgtaactgtcaccttcgacgatggtgttaacgtgaacaacattatc240

acttaccgcaacatcctgtacaaccgactgaactccaacggctgtcccgctggagttacc300

ttcttcgtcagccacgagtacaccaactatgctctcatcaacgagctctataaccagggc360

ttcgaaattgccctacactccatcagtcacagaactcctcaaacctactggttcgaagcc420

accaaagaagttatcaaggaagaaattgctgaccagaaagcccagatggctcacttcgct480

aacattcctcccagcgccattaaaggtgttcgcatgcccttcctccaattggctggcaac540

gctagcttcgaagtcatgcaggaatatggcttggagtacgattgcacttggcctacgatc600

gcccacacaaacccaggactatggccttacaccctggactacgcttcgacccaggactgc660

atcattcctccctgcccatctgcctccatccctggagtttgggttaagcctatggttgcc720

tggtctgacctcaacggagttccttgctcaatggttgacgcttgcttcttcatccctgac780

cgcgaaaatgaagaggaatggtacaagttcatcctcagcaacttcgagaggcactacttg840

ggcaaccgtgctcccttcggcttctacgtccacgaggccttcttggctgccaaccctgcc900

gtcaaccgtgcgctagttcgcttcatggatctggtcaacaatctgaatgatgctttcatg960

gtgaacgcccacgaagtcgtcgactgggttaagaacccgaagccactcaatgagtacagg1020

agccaaggctgccgcagcttcagcccttcaacctgcaaccccaacaactgtggtcctctc1080

ttctccacacacaatcaattggcttactacatgcaagtatgcagcgcttgtcctaacaac1140

tacccatgggtcggcaatcctcttggacaataa1173

<210>2

<211>578

<212>dna

<213>hacda5a

<400>2

atgaagttgttcgggcttcttgctttgttgctggtggcttcggtcttcgctgatgactct60

tcgtcgtcagaagaagaaaatgagggcctgcctttggcagaggcctgtgaccaggaagct120

tgcagcttgcctgactgcagatgttccagcaccaatattcccggaggattgaatccacga180

gatgtaccacaattcgtaactgtcaccttcgacgatggtgttaacgtgaacaacattatc240

acttaccgcaacatcctgtacaaccgcttgaactccaacggctgtcctgccggagtcacc300

ttcttcgtcagtcatgagtacaccaactatgctctcatcaacgagctttataaccagggc360

ttcgaaatcgccctgcactccatcagccacagaactcctcaaacctactggtttgaagcc420

accaaagaggttatcaaggaagaaatcgctgaccagaaagcccagatggctcacttcgct480

aacattcctcccagtgccattaagggtgttcgcatgcccttcctccaattggcaggcaac540

gctagcttcgaaatcatgcaggaatatggcttggagta578

<210>3

<211>643

<212>dna

<213>hacda1

<400>3

atcaacaacaacaacatcgaactttacaaagagatcttcaacggaaaacgtaaaaacccc60

aacggttgcgacattaaggccacatactttatttcgcacaagtacaccaactactcggct120

gttcaggaaactcacagaaagggacatgaaatcgctgtacactcaatcacgcacaacgat180

gacgaacgcttctggagcaacgctaccgttgacgactggggcaaggagatggccggtatg240

agagtcatcatcgagaagttctcgaacatcactgacaacagtgtcgtgggtgtgcgagcg300

ccgtacctccgtgtcggtggtaacaaccagttcaccatgatggaagagcaagccttcttg360

tatgacagcaccatcactgctcccctgtccaacccgccgctatggccatacactatgtac420

ttcagaatgcctcaccgttgtcacggaaacctgcagagctgccccaccaggagccacgcc480

gtgtgggagatggtgatgaacgaacttgaccgtcgtgaggaccccaccaacgatgagtac540

ttgcctggatgcgccatggttgactcttgttctaacattttgacaggagatcagttctac600

aacttcctcaaccacaacttcgacagacattatgaacaaaacc643