HPR1基因突变体及其在制备耳聋诊断试剂中的应用的制作方法

文档序号：17854310发布日期：2019-06-11 22:28阅读：227来源：国知局

本发明涉及生物医学领域中的疾病相关突变基因和分子诊断领域，特别涉及一遗传性迟发型耳聋家系常染色体显性非综合征型耳聋相关的hpr1基因的突变位点，hpr1在制备耳聋诊断试剂中的应用，及一种耳聋hpr1诊断试剂盒，可根据个体hpr1的核酸序列特征对耳聋及听力损失相关疾病进行诊断。

背景技术：

耳聋是人类最严重的疾病之一，患者往往因耳聋而失去正常语言交流的能力，在精神与生活层面承受着巨大的痛苦与不便。全世界新生儿耳聋发病率约为1‰，约15％的成年人具有某种程度的听力损失，而60岁以上人群中则有35-55％存在不同程度的听觉障碍。目前，对于耳聋的治疗手段仍十分有限，且无根治的方法。很多耳聋的发生伴随着听力逐渐损失的过程，早期听力损失不易被发现和诊断，因而导致病情的延误和加重。因此，耳聋相关疾病诊断方法的开发具有极高的医疗应用价值。

毛细胞即听觉感知细胞，主要功能在于感受声音并将声波信号转换成电信号进而将其传递至大脑。毛细胞的损伤和减少等是导致感音神经性耳聋发生的最主要原因。遗传因素在耳聋等听力损失疾病的致病因素中所占比例高达65％以上，对毛细胞的发育和损伤等过程也起到关键的调控作用。耳聋相关基因的发掘与研究，极大地促进了人们对耳聋遗传因素及其机制的认识，也为遗传性耳聋的诊断和治疗提供了新的思路和靶标。

hpr1是组成核糖核蛋白复合体的蛋白成员之一，并参与调控胚胎发育早期一系列基因的协同表达，进而对胚胎形成、器官形成、细胞分化以及癌症的发生等过程产生影响。但目前尚无hpr1与听力损失耳聋间关系的研究报道。

技术实现要素：

本研究采用二代测序技术，通过对耳聋病家族成员进行外显子组测序分析和动物实验验证，发现hpr1突变体与耳聋发生具有显著的相关性。

本发明提供了一种常染色体显性非综合征型耳聋相关的hpr1基因突变体，核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明所提供的常染色体显性非综合征型耳聋hpr1基因突变体，突变位点是：hpr1基因(seqidno:1)编码区第547位核苷酸c突变为g(c.547c>g，p.l183v)，为杂合子。序列分析表明该位置缺失突变引起hpr1基因编码蛋白发生氨基酸突变，导致原野生型hpr1蛋白中第183个氨基酸残基由l变为v。

本发明提供的与非综合征型遗传性耳聋的新的突变基因可应用于医学遗传相关咨询，与衰老有关的听力损失及耳聋相关疾病的早期诊断，以及制备非综合征型耳聋检测试剂等方面。

本发明具体技术方案如下：核苷酸序列seqidno:2所示的hpr1基因突变体序列在制备耳聋疾病诊断试剂中的应用，特别是耳聋的早期诊断。

本发明的另一个目的在于提供一种耳聋疾病诊断的hpr1检测试剂盒，试剂盒包括rna抽提体系、rna反转录反应体系和pcr反应体系，其中pcr反应体系含有特异性扩增seqidno:2基因序列的引物序列，以及用于pcr扩增产物测序的引物序列。

上述检测试剂盒中rna抽提体系包括总rna提取试剂、rna逆转录反应体系包括反转录酶、反转录体系缓冲液和rna酶抑制剂；pcr反应体系包括扩增系统和引物系统，所述扩增系统由primestarhsdnapolymerase试剂组成；所述引物系统包括rna反转录引物和hpr1基因突变体特异性的扩增引物及其测序引物。其中，总rna反转录引物为oligodt引物；

hpr1片段特异性扩增的上游引物序列如seqidno:3所示，下游引物序列如seqidno:4所示，其相应测序引物序列如seqidno:5所示。

上述的检测试剂盒，包括：

(a)抽提体系：

1)trizolreagent，2管，2000μl/管；

2)氯仿，1管，500μl/管；

3)无水乙醇，1管，8000μl/管；

4)rnasefreeddh2o，2管，2000μl/管；

5)异丙醇，8000μl/管；

(b)反转录体系：

1)总rna反转录引物oligodt，1管，浓度：50μm，50μl/管；

2)反转录酶(200u/μl)50μl；

3)dntpmixture(10mmeach)50μl；

4)反转录buffer50μl；

(c)pcr体系：

1)primestarhsdnapolymerase50μl；

2)buffer500μl；

3)dntpmixture(2.5mmeach)250μl；

4)hpr1基因突变体特异性扩增上游引物，1管，10μm，100μl/管；

hpr1基因突变体特异性扩增下游引物，1管，10μm，100μl/管；

hpr1基因突变体测序引物，1管，10μm，100μl/管。

本发明确定了hpr1基因表达序列的突变(c.547c>g，p.l183v)与耳聋的发生存在显著的相关性。hpr1可以作为耳聋早期诊断的生物标记物。

本发明确定hpr1作为耳聋诊断的生物标记物，包括如下步骤：

第一步，样品准备：临床发现一个后天性耳聋病家族，其中已确诊15个后天耳聋病人，提取该家系中耳聋病人血液样本(实验组，9人)和非耳聋个体血液样本(18人)，用trizol法提取各样本的总rna，并保存于-80℃待用。

第二步，样品外显子组测序与致病突变基因分析：利用全外显子组测序技术，对各rna样本进行测序分析。具体内容包括：用illuminatruseqexomeenrichmentkit捕获各样本中所含20794个表达基因的外显子及周边内含子区域序列，microrna序列及其他非编码基因的序列进行测定，测定仪器为hiseq2000测序仪(illumina,sandiego,ca,usa)。所测序列与ncbi37/hg19数据库进行比对分析。分别用soapsnpsoftware和gatkindelgenotyper软件鉴定snp和dna缺失位点。通过与对照基因组数据的比较，筛选寻找候选致病突变基因，并最终确定hpr1基因上的一个突变位点与该家族中耳聋患者间有高度相关性。

第三步，利用动物模型验证hpr1基因在毛细胞中的表达：毛细胞即听觉感知细胞，主要功能在于感受声音并将声波信号转换成电信号进而将其传递至大脑，毛细胞的损伤和减少等是导致感音神经性耳聋发生的最主要原因。本发明利用抗体免疫染色分析和核酸原位杂交技术证实hpr1基因的表达富集在小鼠和斑马鱼的毛细胞中。

第四步，利用动物模型证实hpr1基因的突变可导致毛细胞发育损伤并导致毛细胞的凋亡，进而导致其功能受损。

本发明的另一目的在于提供一种常染色体显性非综合征型耳聋诊断基因芯片，具有检测seqidno:2所示核苷酸序列的hpr1基因突变体的探针。所述探针序列如seqidno:6和seqidno:7所示。

在基因芯片应用中，hhpr1基因突变体的核酸探针与待测样品中hpr1基因杂交而产生荧光信号，通过信号的强弱来反映hpr1与探针之间的互补程度，进而用于检测待测样品hpr1序列中是否发生了基因突变。

本发明为耳聋疾病的早期诊断和早期干预治疗提供重要的参考依据，具有较大的实际临床价值，可以用于筛选出耳聋疾病的高危人群和复发人群，以期及早进行干预和治疗。

附图说明

图1为临床发现的耳聋病患者家系图谱。

图2为外显子组测序分析所发现的耳聋患者hpr1突变的基因位点。

图3为hpr1基因在动物模型小鼠和斑马鱼体内毛细胞中的表达验证。

图4为hpr1基因在斑马鱼中被敲除后导致毛细胞发育受到损伤。

图5为hpr1基因在斑马鱼中被敲除后诱发毛细胞的凋亡。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1hpr1与耳聋疾病相关性验证

第一步，样品准备：临床发现一个后天性耳聋病家族(如图1所示)，其中已确诊15个后天耳聋病人，分别提取该家系中耳聋病人(实验组，9人)和非耳聋个体外周血样本(18人)，用trizol法提取各样本的总rna，并保存于-80℃待用。

第二步，样品外显子组测序与致病突变基因分析：利用全外显子组测序技术，对各rna样本进行测序分析。具体内容包括：用illuminatruseqexomeenrichmentkit捕获各样本中所含20794个表达基因的外显子及周边内含子区域序列，microrna序列及其他非编码基因的序列进行测定，测定仪器为hiseq2000测序仪(illumina,sandiego,ca,usa)。所测序列与ncbi37/hg19数据库进行比对分析。分别用soapsnpsoftware和gatkindelgenotyper软件鉴定snp和dna缺失位点。通过与对照基因组数据的比较，筛选寻找候选致病突变基因，并最终确定hpr1基因表达序列上第547位核苷酸c突变为g，使得其编码的蛋白质第183位氨基酸由l突变为v(c.547c>g，p.l183v)，与该家族中耳聋病的发生有高度相关性(如图2所示)。

第三步，利用动物模型验证hpr1基因在毛细胞中的表达：毛细胞即听觉感知细胞，主要功能在于感受声音并将声波信号转换成电信号进而将其传递至大脑。毛细胞的损伤和减少等是导致感音神经性耳聋发生的最主要原因。本发明利用核酸原位杂交技术证实hpr1基因的表达富集在斑马鱼的毛细胞中(如图3所示)。具体流程如下：以hpr1的基因编码区序列为模板设计其原位杂交探针，pcr扩增该探针序列并将其构建至t-easy克隆质粒中，用体外转录试剂盒制备带有荧光标记的rna探针，将探针与固定的48h斑马鱼胚胎混合，在70℃下进行孵育杂交，杂交完成后加入抗体，进行显色反应并观察结果。图3a，3b，3c和3d均为斑马鱼hpr1基因的核酸原位杂交分析结果，红色箭头所指蓝色圆点表示hpr1的表达区域，与斑马鱼神经丘位置相符，表明hpr1在斑马鱼神经丘(毛细胞聚集区域)中有高表达。

第四步，利用动物模型证实hpr1基因的突变可导致毛细胞发育损伤并导致毛细胞的凋亡(如图4，图5所示)。本发明利用毛细胞特异性荧光标记的斑马鱼为对象，用crispr-cas9基因敲除技术将其hpr1基因敲除，通过观察斑马鱼胚胎发育过程中毛细胞特异性荧光表达量的变化来反映毛细胞的发育是否收到影响，同时用细胞凋亡检测试剂盒对斑马鱼体内毛细胞区域可能存在的细胞凋亡情况进行检测。图4a和4c分别为hpr1基因敲除后斑马鱼胚胎在48h和72h时体内毛细胞的发育情况检测，结果表明hpr1缺失后毛细胞发育受损，数量明显减少(绿色荧光点减少)。图4b和图4d分别为hpr1基因敲除48h和72h后斑马鱼体内(头部和躯干部)毛细胞簇数量变化的统计情况(共聚焦显微镜下观察统计)，结果表明，hpr1基因敲除后毛细胞簇数量显著下降。图5a为共聚焦显微镜下毛细胞的发育情况，发现hpr1基因敲除后的毛细胞形态不完整，且数量减少，部分呈碎片状；图5b为敲除hpr1基因后斑马鱼中毛细胞凋亡情况的检测，结果表明hpr1的缺失导致严重的毛细胞凋亡现象，蓝色表示毛细胞的细胞核，绿色为细胞凋亡的信号，两种颜色相重叠，表明有毛细胞发生了凋亡。

实施例2制备本发明的试剂盒

hpr1突变体的序列如seqid:no:2所示，其特异性pcr上下游引物通过primer5设计，由invitrogen公司负责引物合成，纯度为page级，合成后的引物采用rnasefreeh2o溶解，总浓度为10μm。

制备包括以下组成成分的试剂盒：

(a)抽提体系：

1)trizolreagent，2管，2000μl/管；

2)氯仿，1管，500μl/管；

3)无水乙醇,1管，8000μl/管；

4)rnasefreeddh2o，2管，2000μl/管；

5)异丙醇，8000μl/管；

(b)反转录体系：

1)总rna反转录引物oligodt，1管，浓度：50μm，50μl/管；

2)反转录酶(200u/μl)50μl；

3)dntpmixture(10mmeach)50μl；

4)反转录buffer50μl；

(c)pcr体系：

1)primestarhsdnapolymerase50μl；

2)buffer500μl；

3)dntpmixture(2.5mmeach)250μl；

4)hpr1基因突变体特异性扩增上游引物(seqidno:3)，1管，10μm，100μl/管；

hpr1基因突变体特异性扩增下游引物(seqidno:4)，1管，10μm，100μl/管；

hpr1基因突变体片段测序引物(seqidno:5)，1管，10μm，100μl/管。

实施例3在耳聋患者外周血细胞中hpr1基因的序列检测

在外周血细胞中加入trizol后室温放置10min，使样品充分裂解。每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。4℃12,000rpm离心15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底。rna沉淀中加入1ml75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mltrizol加入1ml75％乙醇。4℃8,000rpm离心5min，弃上清。室温放置晾干后，在沉淀内加入50μlrnase-free水，以充分溶解rna，-70℃保存。

rna质量检测：在260nm和280nm吸光度处，采用紫外分光光度计测定rna的浓度；rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。同时，结合琼脂糖凝胶电泳检测rna质量，紫外透射光下观察并拍照。

rna逆转录获得cdna样本：逆转录采用用takara公司primescripttmrtreagentkit，按照试剂盒提供的体系(20μl)分别加入：

将以上体系置于无rnase的0.2μlep管中，按下面程序反转录为cdna：42℃30min，95℃5min，得到的cdna放于-20℃中保存。

pcr扩增hpr1表达序列，反应体系如下：

pcr条件：95℃5min,(95℃30s；55℃30s；72℃2min,40个循环)，72℃5min。

序列测定与结果分析：

将hpr1的pcr反应产物送生物公司进行序列测定，并将所得序列与参考序列进行比对，找到其序列中的突变碱基，并与野生型hpr1参考序列(seqid:no:1)作对比，如果待测样品hpr1发生与突变型hpr1(seqid:no:2)相对应的碱基突变，则判断其为遗传性耳聋疾病阳性。

序列表

<110>南通大学

<120>hpr1基因突变体及其在制备耳聋诊断试剂中的应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1968

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgtctcctccgtctcacttcgacttcattgaagccagagataaatttacggttgccact60

aaaaatgcggttgataccaggaactgtaagcctctgaccaccgctttcagtcatcttcct120

ggaaacgaaacggagaaaaaggccacacttgatcaagctctgcgtggagttctggaagag180

cagatagtgaatcagaaagtgaatgttgacgacttcctttctttaatctacatcagtatt240

gatggtgtgactgaaggcatctgctctgctaccactcctttccttctgctgggagatgtg300

ctggactgtctgcctctggatcagtgtgacaaaatcttctcctttgtcgaagaaaacgta360

tctacttggaagtctaacacattttactctgctgggaaaaactacttgttaaggatgtgc420

aacgacctcctcagaagactctctaaatctcagaacacggtgttttgtggacgaatccag480

ctgtttttagcacgtctcttccccctgtcggaaaaatcaggactaaacctacagagccag540

ttcaaccttgataacatcacagtgttcaacaaaaatgagcaggacagcacactgggacag600

cagcacacagaggttaaggaggaaggaatggatgtggaggagggagaaatgggggatgaa660

gatgctcctgctccaagctccattcctattgactacaacttgtacagaaaattctggacc720

ctgcaggactatttcagaaaccctgttcagtgctacgacaagttctcctggatgactttc780

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aagttcctgaccagtgagaaattgatggatcttcagctgagcgacagcaacttcagaaga960

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aacgcagccggtttcaacaacatcgcagataatctgagcgaaacataa1968

<210>2

<211>1968

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2