一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法与流程

本发明涉及麻类原料处理技术领域，具体涉及一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法。

背景技术：

麻类韧皮原料是世界上重要的天然纤维来源之一。农产品麻类韧皮原料除含有大量纤维素纤维外，还包含有果胶、半纤维素、木质素等“胶质”成分。无论利用麻韧皮纤维开发何种纺织产品，都必须经过“脱胶”，除去韧皮纤维原料的非纤维素物质。因此，脱胶是麻类韧皮纤维原料加工过程中基础而关键的环节。麻类生物脱胶因其“高效、节能、低排”备受青睐。

生物脱胶的核心是高效菌种。国内外报道一系列有关麻类生物脱胶菌株，如：erwiniasp.(henrikssonetal.,1999)、rhizomucorpusillus(brühlmannetal.,2000)、amycolatasp.(duanetal.,2012)、bacillustequilensis(chiliverietal.,2016)，但这些菌株还存在培养条件苛刻、生长周期长、脱胶不彻底等缺陷，限制了其在工业化生产中的大规模应用。

申请人所在课题组前期选育到麻类脱胶高效菌种dce-01，能同时高效处理涉及苎麻、红麻、黄麻、亚麻、工业大麻5种韧皮纤维原料，在6-10h完成脱胶。截止2013年底，该课题组利用该菌种先后建成麻类生物脱胶示范工程5个，累计生产麻类纤维10余万吨，占全国麻类农产品工厂化脱胶能力30％以上。

然而，dce-01菌种属于热敏性的革兰氏阴性菌，其菌种制备技术比较难，尤其是菌种易退化和变异的技术问题制约了其在麻类生物脱胶的进一步扩大应用。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法，包括，将活化后的dce-01种子液接种至fj发酵培养液中扩培发酵，获得成熟发酵液后收集湿润菌体，随后添加保护剂于湿润菌体上并混合均匀得到湿润菌粉，最后将湿润菌粉平铺后在32-35℃下烘干即得。

具体地，所述fj发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖1.8-2.4％+玉米浆干粉1.5-2.8％+豆粕粉0.8-1.3％+蛋白胨0.08-0.12％+nano30.12-0.20％，余量为水。

在上述技术方案中，所述扩培发酵的方法为：按体积比为1∶25-36的比例将所述dce-01种子液与所述fj发酵培养液置于密封的发酵罐中，控制灌装量为发酵罐容积的50-60％，同时通过添加nh3·h2o控制ph值为6.7-7.0，33-35℃，搅拌速度为180-200r/min，对应于每升种子液的通气量为0.5-0.7m³/h，发酵培养9-11h直至其ph值恒定或上升。

在上述技术方案中，在用于扩培发酵前，所述fj发酵培养液在121℃下灭菌30min，且在灭菌前用nh3·h2o调ph值为7.0-7.5。

进一步地，在上述技术方案中，所述成熟发酵液中dce-01菌的浓度大于1*10⁹cfu/ml。

详细地，在实际应用过程中，所述成熟发酵液通常需做脱胶实验以验证其菌活力，具体方法如下：取35℃预热的自来水按2wt％的量添加成熟发酵液配成菌悬液，称取苎麻20g，用适量的菌悬液(苎麻与菌悬液按浴比1∶10)在35℃条件下浸泡10min后，倒掉多余的菌悬液，静置脱胶6-8h，检验其活力。

如果在35℃下静置培养6h开始变蓝，8h全部变蓝，并且纤维软化，分散性好，说明dce-01菌种活力高。

在上述技术方案中，所述湿润菌体的收集方法为离心分离，离心转速为3000-5000r/min，离心时间为20-30min。

详细地，由于所述fj发酵培养液中含有玉米浆干粉和豆粕粉，大幅度增加了其沉降系数，沉淀效果良好。此外，取离心分离后的上清液做镜片检测，用结晶紫染色，在油镜(40×100倍)下观察菌体数量，每个视野中菌体的数量少于8个，证明离心的效果良好。

进一步地，在上述技术方案中，所述保护剂为灭菌麸皮，优选地，所述湿润菌体与所述灭菌麸皮的质量比为1∶3-7。

在上述技术方案中，所述湿润菌粉的烘干方法为：将湿润菌粉平铺于不锈钢网筛上，控制平铺厚度为1-2cm，采用32-35℃的冷风烘25-40min，直至其含水量为6-8％。

进一步地，在上述技术方案中，所述dce-01菌种的活化方法为：将所述混有dce-01菌苔的gr培养液接种至30-50倍体积的gr培养液中并混匀，在33-35℃和150-180r/min条件下培养5-6h得一级种子液，随后再将一级种子液与200-350倍体积的gr培养液混匀，在33-35℃和150-180r/min条件下培养5-6h得二级种子液。

再进一步地，在上述技术方案中，所述gr培养液的质量比配方为：葡萄糖1％+牛肉膏0.5％+蛋白胨0.5％+nacl0.5％，并用naoh调ph值为7.0-7.5。

又进一步地，在上述技术方案中，所述dce-01菌苔的制备方法为：将dce-01菌种接种至gr培养液中并混匀，在33-35℃下培养5-6h，稀释后涂布于yq营养琼脂平板中，在33-35℃下培养18-20h后分离单菌落，挑选典型菌落划线于新鲜斜面上，在33-35℃下培养18-20h后真空包装，常温保存，一周内有效。

本发明的优点：

(1)本发明所提供的麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法，通过调整fj发酵培养液的配方，采用玉米浆干粉和豆粕粉替代大部分蛋白胨，大大降低了生产成本，并且这两种新氮源能改变培养液的整体性质，促进后续成熟发酵液中菌体沉降，起到絮凝的效果；

(2)本发明所提供的麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法，通过选用灭菌麸皮作为保护剂，灭菌麸皮的菌体吸附容量大，且灭菌麸皮蓬松的特性降低了后续干燥的负荷，实际应用效果优异；

(3)本发明所提供的麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法，针对热敏性革兰氏阴性菌dce-01菌种，通过采用冷风常压干燥方法，既最大限度保护了dce-01菌种免受伤害，又节约能源；

(4)本发明所提供的麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法，方法简单、成本低廉、易于推广应用，实际应用前景广阔，理论和实际意义重大。

附图说明

图1为本发明实施例所提供麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得，若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法

如图1所示，从中国农业科学院麻类研究所彭源德教授课题组保存的斜面原种菌苔挑取一环dce-01菌种接种至5ml改良肉汤培养液(gr培养液)，充分悬匀，35℃培养6h；稀释后涂布于yq营养琼脂平板，35℃培养20h，分离单菌落；挑选典型菌落划线于新鲜斜面，35℃培养20h，真空包装，常温保存；把1ml的灭菌的改良肉汤培养液(gr培养液)倒入1支上述斜面菌种，用接种环轻轻刮表面菌苔，保证菌苔全部混入培养液。

具体地，上述gr培养液的质量比配方为：葡萄糖1％+牛肉膏0.5％+蛋白胨0.5％+nacl0.5％，并用naoh调ph值为7.5。

将混有菌苔的液体接种至盛有40ml改良肉汤培养液(gr培养液)的100ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养5h，即为一级种子液；再将一级种子液接种至盛有1000ml改良肉汤培养液(gr培养液)的3500ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养6h，即为二级种子液。

将二级种子液直接接种至盛有30lfj发酵培养液的50l发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加nh3·h2o，使ph维持至6.7，通气量0.7m³/h，34℃，180r/min培养10h，即培养至ph略有上升，终止发酵，收获成熟发酵液。

具体地，上述fj发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖2.0％+玉米浆干粉2.0％+豆粕粉1.0％+蛋白胨0.1％+nano30.15％，余量为水，其中，豆粕粉的粒径小于100目。

参照标准《进出口食品中乳酸菌检验方法》(sn/t1941.1-2017)，用梯度稀释法对成熟发酵液中的dce-01活菌进行分离与计数，活菌数达4.2×10⁹cfu/ml。

取35℃预热的自来水按2％添加dce-01成熟发酵液配成菌悬液，称取苎麻20g，用200ml菌悬液(苎麻与菌悬液按浴比1∶10)在35℃条件下浸泡10min后，倒掉多余的菌液，35℃静置脱胶，培养6h开始苎麻开始变蓝，7.5h全部变蓝，并且纤维软化，分散性好，验证了dce-01菌种活力高。

采用离心的方法收集成熟发酵液中的菌体，离心转速为4000r/min，离心时间为20min。取离心的上清液做镜片检测，用结晶紫染色，在油镜(40×100倍)下观察菌体数量，每个视野菌体数量为4-6个菌体，离心效果良好。

称量菌体的湿重为1.81kg，添加相同重量添加灭菌的麸皮1.8kg，充分拌匀后，将湿菌粉平铺于不锈钢网筛，使其厚度为1cm。在茶叶烘干机冷风鼓风条件下，32℃烘30min左右(每10min混匀平铺一次)。用粉碎机把菌粉粉碎过100目筛子，真空包装，即为成品固态菌剂。用水分测定仪检测成品固态菌剂水分含量约为6-8％，梯度稀释法测得dce-01活菌计数为1.19×10¹⁰cfu/g。

经过核算，通过实施例1的固态菌粉制备，dce活菌的回收率为34.1％。

实施例2一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法

从中国农业科学院麻类研究所彭源德教授课题组保存的斜面原种菌苔挑取一环dce-01菌种接种至5ml改良肉汤培养液(gr培养液)，充分悬匀，35℃培养6h；稀释后涂布于yq营养琼脂平板，35℃培养18h，分离单菌落；挑选典型菌落划线于新鲜斜面，35℃培养18h，真空包装，常温保存；把1ml的灭菌的改良肉汤培养液(gr培养液)倒入1支上述斜面菌种，用接种环轻轻刮表面菌苔，保证菌苔全部混入培养液。

具体地，上述gr培养液的质量比配方为：葡萄糖1％+牛肉膏0.5％+蛋白胨0.5％+nacl0.5％，并用naoh调ph值为7.2。

将混有菌苔的液体接种至盛有50ml改良肉汤培养液(gr培养液)的100ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养5h，即为一级种子液；再将一级种子液接种至盛有1000ml改良肉汤培养液(gr培养液)的3500ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养6h，即为二级种子液。

将二级种子液直接接种至盛有25lfj发酵培养液的50l发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加nh3·h2o，使ph维持至6.7，通气量0.5m³/h，34℃，180r/min培养10h，即培养至ph略有上升，终止发酵，收获成熟发酵液。

具体地，上述fj发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖2.4％+玉米浆干粉1.6％+豆粕粉1.2％+蛋白胨0.1％+nano30.15％，余量为水，其中，豆粕粉的粒径小于100目。

参照标准《进出口食品中乳酸菌检验方法》(sn/t1941.1-2017)，用梯度稀释法对成熟发酵液中的dce-01活菌进行分离与计数，活菌数达3.98×10⁹cfu/ml。

取35℃预热的自来水按2％添加dce-01成熟发酵液配成菌悬液，称取苎麻20g，用200ml菌悬液(苎麻与菌悬液按浴比1∶10)在35℃条件下浸泡10min后，倒掉多余的菌液，35℃静置脱胶，培养6h开始苎麻开始变蓝，7.5h全部变蓝，并且纤维软化，分散性好，验证了dce-01菌种活力高。

采用离心的方法收集成熟发酵液中的菌体，离心转速为5000r/min，离心时间为30min。取离心的上清液做镜片检测，用结晶紫染色，在油镜(40×100倍)下观察菌体数量，每个视野菌体数量为4-6个菌体，离心效果良好。

称量菌体的湿重为1.48kg，添加相同重量添加灭菌的麸皮1.5kg，充分拌匀后，将湿菌粉平铺于不锈钢网筛，使其厚度为1cm。在茶叶烘干机冷风鼓风条件下，35℃烘25min左右(每10min混匀平铺一次)。用粉碎机把菌粉粉碎过100目筛子，真空包装，即为成品固态菌剂。用水分测定仪检测成品固态菌剂水分含量约为6-8％，梯度稀释法测得dce-01活菌计数为9.8×10⁹cfu/g。

经过核算，通过实施例2的固态菌粉制备，dce活菌的回收率为29.4％。

对比例1一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法

从中国农业科学院麻类研究所彭源德教授课题组保存的斜面原种菌苔挑取一环dce-01菌种接种至5ml改良肉汤培养液(gr培养液)，充分悬匀，35℃培养6h；稀释后涂布于yq营养琼脂平板，35℃培养20h，分离单菌落；挑选典型菌落划线于新鲜斜面，35℃培养20h，真空包装，常温保存；把1ml的灭菌的改良肉汤培养液(gr培养液)倒入1支上述斜面菌种，用接种环轻轻刮表面菌苔，保证菌苔全部混入培养液。

具体地，上述gr培养液的质量比配方为：葡萄糖1％+牛肉膏0.5％+蛋白胨0.5％+nacl0.5％，并用naoh调ph值为7.5。

将混有菌苔的液体接种至盛有40ml改良肉汤培养液(gr培养液)的100ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养5h，即为一级种子液；再将一级种子液接种至盛有1000ml改良肉汤培养液(gr培养液)的3500ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养6h，即为二级种子液。

将二级种子液直接接种至盛有30l改良肉汤培养液(gr培养液)的50l发酵罐(瑞士比欧，德国)中，通气量0.7m³/h，34℃，180r/min培养10h，即培养至ph略有上升，终止发酵，收获成熟发酵液。

具体地，上述扩大培养用gr培养液与上述dce-01菌种的活化用gr培养液的质量比配方相同。

参照标准《进出口食品中乳酸菌检验方法》(sn/t1941.1-2017)，用梯度稀释法对成熟发酵液中的dce-01活菌进行分离与计数，活菌数达8.27×10⁸cfu/ml。

取35℃预热的自来水按2％添加dce-01成熟发酵液配成菌悬液，称取苎麻20g，用200ml菌悬液(苎麻与菌悬液按浴比1∶10)在35℃条件下浸泡10min后，倒掉多余的菌液，35℃静置脱胶，培养6h开始苎麻开始变蓝，7.5h全部变蓝，并且纤维软化，分散性好，验证了dce-01菌种活力高。

采用离心的方法收集成熟发酵液中的菌体，离心转速为5000r/min，离心时间为40min。取离心的上清液做镜片检测，用结晶紫染色，在油镜(40×100倍)下观察菌体数量，每个视野菌体数量为4-6个菌体，离心效果良好。

称量菌体的湿重为0.88kg，添加相同重量添加灭菌的麸皮0.9kg，充分拌匀后，将湿菌粉平铺于不锈钢网筛，使其厚度为1cm。在茶叶烘干机冷风鼓风条件下，32℃烘30min左右(每10min混匀平铺一次)。用粉碎机把菌粉粉碎过100目筛子，真空包装，即为成品固态菌剂。用水分测定仪检测成品固态菌剂水分含量约为6-8％，梯度稀释法测得dce-01活菌计数为1.89×10⁹cfu/g。

经过核算，通过实施例1的固态菌粉制备，dce活菌的回收率为13.6％。

与本发明实施例1相比，采用该改良肉汤培养基做dce-01菌的扩大培养，其成本提高了约4倍；同时，由于培养基成分的颗粒较细，导致菌体沉降所需离心力增大，离心时间延长。

对比例2一种麻类生物脱胶用固态菌剂的制备方法

从中国农业科学院麻类研究所彭源德教授课题组保存的斜面原种菌苔挑取一环dce-01菌种接种至5ml改良肉汤培养液(gr培养液)，充分悬匀，35℃培养6h；稀释后涂布于yq营养琼脂平板，35℃培养20h，分离单菌落；挑选典型菌落划线于新鲜斜面，35℃培养20h，真空包装，常温保存；把1ml的灭菌的改良肉汤培养液(gr培养液)倒入1支上述斜面菌种，用接种环轻轻刮表面菌苔，保证菌苔全部混入培养液。

具体地，上述gr培养液的质量比配方为：葡萄糖1％+牛肉膏0.5％+蛋白胨0.5％+nacl0.5％，并用naoh调ph值为7.5。

将混有菌苔的液体接种至盛有40ml改良肉汤培养液(gr培养液)的100ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养5h，即为一级种子液；再将一级种子液接种至盛有1000ml改良肉汤培养液(gr培养液)的3500ml三角瓶中，充分混匀，35℃，180r/min水浴摇床培养6h，即为二级种子液。

将二级种子液直接接种至盛有30lfj发酵培养液的50l发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加nh3·h2o，使ph维持至6.9，通气量0.5m³/h，34℃，180r/min培养10h，即培养至ph略有上升，终止发酵，收获成熟发酵液。

具体地，上述fj发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖2.4％+玉米浆干粉1.6％+豆粕粉1.3％+蛋白胨0.1％+nano30.15％，余量为水，其中，豆粕粉的粒径小于100目。

参照标准《进出口食品中乳酸菌检验方法》(sn/t1941.1-2017)，用梯度稀释法对成熟发酵液中的dce-01活菌进行分离与计数，活菌数达3.87×10⁹cfu/ml。

取35℃预热的自来水按2％添加dce-01成熟发酵液配成菌悬液，称取苎麻20g，用200ml菌悬液(苎麻与菌悬液按浴比1∶10)在35℃条件下浸泡10min后，倒掉多余的菌液，35℃静置脱胶，培养6h开始苎麻开始变蓝，7.5h全部变蓝，并且纤维软化，分散性好，验证了dce-01菌种活力高。

采用离心的方法收集成熟发酵液中的菌体，离心转速为4000r/min，离心时间为20min。取离心的上清液做镜片检测，用结晶紫染色，在油镜(40×100倍)下观察菌体数量，每个视野菌体数量为4-6个菌体，离心效果良好。

称量菌体的湿重为1.72kg，添加相同重量添加灭菌的豆饼粉1.7kg，充分拌匀后，将湿菌粉平铺于不锈钢网筛，使其厚度为1cm。在茶叶烘干机冷风鼓风条件下，35℃烘50min左右(每10min混匀平铺一次)。用粉碎机把菌粉粉碎过100目筛子，真空包装，即为成品固态菌剂。用水分测定仪检测成品固态菌剂水分含量约为6-8％，梯度稀释法测得dce-01活菌计数为8.2×10⁸cfu/g。

经过核算，通过实施例1的固态菌粉制备，dce活菌的回收率为2.42％。

与本发明实施例1相比，以灭菌豆饼粉为保护剂时，其对菌的吸附性能比麦麸差，豆饼吸收的水分也不易干燥，从而导致其对活菌的保护效果差，大大降低了dce活菌的回收率。

此外，采用本发明实施例1-2和对比例1-2所制得的菌粉对苎麻进行脱胶试验，脱胶后苎麻的变蓝程度及其纤维柔软度与分散度等指标的测试结果表明，所制得的菌粉的脱胶效果从强到弱依次为：实施例1＞实施例2＞对比例1＞对比例2。

最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。