本发明属于医药领域，涉及一种吡唑类衍生物、其制备方法、含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂特别是作为ret蛋白激酶抑制剂的用途。
背景技术：
：ret蛋白(rerrangedduringtransfection，转染期间重排)属于受体型酪氨酸激酶家族，作为神经生长因子的受体，其功能涉及神经系统的正常生长发育，细胞增殖和存活。胶质细胞衍生的神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,gdnf)家族配体(gfl)通过与ret结合来调节下游信号，gfl家族还包括neurturin(ntrn)、artemin(artn)和persephin(pspn)(arighietal.,cytokinegrowthfactorrev.,2005,16,441-67)。与其他受体酪氨酸激酶不同，ret激活需要配体，gdnf家族受体α蛋白以及ret蛋白形成多聚体复合物。gfrα受体通过糖基磷脂酰肌醇键连接到细胞表面的共受体(co-receptor)，现已发现该家族包括4种亚型(gfrα1-4)，能够与不同gfl结合。首先gfl和gfrα家族成员形成二元复合物，复合物再与ret结合并将其募集到细胞膜上被称为脂筏(lipidraft)的胆固醇富集的次级结构域，诱导ret发生二聚化并形成gfl(2)-gfra(2)-ret(2)异六聚体复合物，激活ret激酶活性以及下游信号。在配体-共受体复合物结合后，ret发生二聚化并诱使蛋白胞内酪氨酸残基自磷酸化，之后进一步招募其他连接蛋白和信号传导蛋白从而激活多中下游信号传导途径，包括ras-mapk通路和pi3k-akt/mtor信号通路。ret异常与肿瘤疾病的发生发展密切相关，主要表现为功能获得性基因突变或因基因重排产生的ret融合蛋白，两者均会引起ret信号的持续异常活化。例如在家族性甲状腺髓样癌患者中，ret点突变比例高达95％；在乳头状甲状腺癌患者中，ret基因重排发生率约为20％～40％；此外，在乳腺癌，结肠癌、胰腺癌、急性白血病中还可观察到ret蛋白过量表达的情况。(loism.mulligan；retrevisitedexpandingtheoncogenicportfolio,naturereviewscancer14,173-186(2014))。上述存在ret融合蛋白及ret点突变的肿瘤都依赖于ret激酶活化来维持肿瘤细胞的增殖和存活，这种依赖性通常被称为“致癌基因成瘾”(oncogeneaddiction)，使得这类肿瘤对靶向ret的小分子激酶抑制剂高度敏感。目前已有部分靶向多个激酶的小分子激酶抑制剂具有ret激酶的抑制活性，如凡德替尼(vandetinib)，卡博替尼(cabozantinib)已被fda批准用甲状腺癌的治疗，其他如ponatinib，nintedanib，lenvatinib等也在针对存在ret信号异常活化的肿瘤开展临床研究，但由于缺乏针对ret蛋白的选择性，上述多重激酶抑制剂在药效和安全性上均存在不同的问题，从而限制了其在ret异常肿瘤中的进一步研究和应用。因此，临床上迫切需要高选择性靶向ret蛋白的小分子激酶抑制化合物。目前已经公开了一系列的选择性ret激酶抑制剂专利，其中包括wo2017011776、wo2018071447、wo2018136661等，处于临床ii期研究的药物主要为loxo-292。但这些现有技术中公开的化合物以及试验药物在有效性、安全性或选择性等方面仍然存在问题，加之目前对于ret在肿瘤中所扮演的角色的认知也在不断深入，仍有必要研究和开发新的小分子选择性ret激酶抑制剂，以填补和满足临床针对ret异常疾病的治疗需要。技术实现要素：本发明人通过实验研究出乎意料地发现，通式(i)的化合物可以有效地抑制ret激酶。本发明提供一种通式(i)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：其中：x1和x2各自独立地选自n和c(r5)；环a选自基团：其中环a基团下方标记的波浪线表示环a的键与-c(＝o)的链接点；环a基团上方标记的波浪线表示环a的键与芳香环的链接点；其中所述的环a任选进一步被一个或多个选自卤素、烷基、羟基或烷氧基的取代基所取代，其中所述的烷基或烷氧基任选进一步被一个或多个卤素所取代；环b选自芳基或杂芳基；优选为吡啶基；r1和r4相同或不同，各自独立地选自氢原子、烷基、烯基、硝基、氰基、炔基、烷氧基、卤素、杂环基、环烷基、芳基、杂芳基、-c(o)r6、-oc(o)r6、-c(o)or6、-(亚烷基)-c(o)r6、-sr6、-s(o)2r6、-s(o)2-n(r7)(r8)、-(亚烷基)-s(o)2r6、-(亚烷基)-s(o)2-n(r7)(r8)、-n(r7)(r8)、-c(o)-n(r7)(r8)、-n(r7)-c(o)r8、-n(r7)-c(o)or8、-(亚烷基)-n(r7)-c(o)r8、-n(r7)s(o)2r8和-p(o)(r7)(r8)；其中所述的烷基、亚烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个ra所取代；或者，两个r1与它们所连接的原子形成一起4～8元环烷基或杂环基，其中所述的环烷基或杂环基任选进一步被一个或多个ra所取代；r1优选为烷基；更优选为甲基；r2选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基或-n(r7)(r8)；其中所述的烷基、烷氧基、环烷基或杂环基任选进一步被一个或多个ra取代；r2优选为烷基或卤代烷基；更优选为甲基；r3选自氢原子、卤素、烷基或烷氧基，其中所述的烷基或烷氧基任选且独立地被一个或多个ra取代；r3优选为烷基或卤代烷基；更优选为甲基；r5独立地选自氢原子、烷基、烷氧基、卤基、杂环基和-n(r7)(r8)；其中所述的烷基、烷氧基和杂烷基任选且独立地被0～5个ra取代；r6、r7和r8各自独立地选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个rb取代；或者，r7和r8与它们所连接的原子一起形成4～8元环烷基或杂环基，其中所述的环烷基或杂环基任选进一步被一个或多个rb取代；ra和rb相同或不同，各自独立地选自氢原子、羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)(r9)、-c(o)o(r9)、-oc(o)(r9)、-n(r10)(r11)、-c(o)n-(r10)(r11)、-nr10-c(o)(r11)、-nr10-s(o)2(r11)或-so2-n(r10)(r11)，其中所述的烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选且独立地被一个或多个rc取代；r9、r10和r11各自独立地选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个rc取代；rc各自独立地选自选自氢原子、羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羧基或羧酸酯基；m为0、1或2；且n为0、1、2、3、4或5。本发明的优选方案，一种通式(i)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中r4为杂芳基；优选为5～6元杂芳基，更优选为吡唑基，其中所述的杂芳基任选进一步被一个或多个选自烷基、烷氧基、卤素或卤代烷基的取代基所取代。本发明的优选方案，一种通式(i)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其为通式(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：其中：环a、x1、x2、r1、r2和m的定义如权利要求1所述。本发明的优选方案，一种通式(i)或(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中x1选自ch，x2选自n。本发明的典型化合物包括但不限于：上述典型化合物包括其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐。本发明提供一种通式(i)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐的制备方法，所述方法包括：通式(ia)化合物和通式(ib)化合物进行缩合反应，任选进一步脱去保护基pg1和pg2，得到通式(i)化合物；其中：x选自羟基或卤素；pg1和pg2选自氨基保护基，优选为bn-o-ch2-；环a、环b、x1、x2、r1～r4、m和n的定义如通式(i)中所述。进一步，本发明一种通式(ia)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：x选自羟基或卤素；pg1和pg2选自氨基保护基，优选为bn-o-ch2-；环a、x1、x2、r1～r2和m的定义如通式(i)中所述。通式(ia)的典型化合物包括但不限于：上述典型化合物包括其立体异构体、互变异构体、游离态或其他可药用的盐。本发明提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的根据权利要求1～7中任一项所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。本发明提供一种通式(i)或(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备ret或突变的ret抑制剂的药物中的用途。本发明提供一种通式(i)或(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备用于治疗与ret异常介导的疾病的药物中的用途，其中所述的疾病优选为癌症、纤维发育不良和遗传障碍，其中所述的癌症优选为非小细胞肺癌、甲状腺癌、实体瘤、结肠癌或胰腺癌，更优选为非小细胞肺癌、甲状腺癌、实体瘤。本发明提供一种通式(i)或(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备用于治疗对癌症产生抗体的受试者的药物中的用途。发明的详细说明除非有相反陈述，否则本发明在说明书和权利要求书中所使用的部分术语定义如下：“烷基”指饱和脂肪族烃基团，包括1-20个碳原子，或1-10个碳原子，或1-6个碳原子，或1-4个碳原子，或1-3个碳原子，或1-2个碳原子饱和直链或支链的单价烃基，其中烷基可以独立任选地被一个或多个本发明所描述地取代基所取代。烷基基团更近一步地实例包括，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是任选取代或未取代的。“亚烷基”是二价烷基。优选为1-10碳原子的亚烷基，更优选为1-6个碳原子亚烷基，特别优选为1-4个碳原子亚烷基。亚烷基基团的实施例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚正丙基等。亚烷基可以是取代或未取代的。“烯基”指2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子直链或支链的一价烃基，其中至少一个c-c为sp2双键，其中烯基的基团可以独立任选地被1个或多个本发明所描述的取代基所取代，其中具体的实例包括，但并不限于乙烯基、烯丙基和烯丁基等等。烯基可以是任选取代或未取代的。“炔基”指2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子直链或支链的一价烃基，其中至少一个c-c为sp三键，其中炔基基团可以独立任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，具体的实例包括，但并不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等。炔基可以是任选取代或未取代的。“环烷基”是指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包括3至20个碳原子，优选包括3至12个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实施例包括，但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。环烷基可以是任选取代的或未取代的。“螺环烷基”指5至18元，两个或两个以上环状结构，且单环之间彼此共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，环内含有1个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺、双螺或多螺环烷基，优选为单螺和双螺环烷基，优选为4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元。“螺环烷基”的非限制性实施例包括但不限于：“稠环烷基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构彼此公用一对碳原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，优选为6至12元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。“稠环烷基”的非限制性实施例包括但不限于：“桥环烷基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构，彼此共用两个不直接相连接碳原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，优选为6至12元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。“桥环烷基”的非限制性实施例包括但不限于：所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实施例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。“杂环基”、“杂环”或“杂环的”在本申请中可交换使用，本申请中可交换使用，都是指包含3-12个环原子的饱和或部分不饱和的单环、双环或三环的非芳香性杂环基，其中至少一个环原子原子是杂原子，如氧、氮、硫原子等。优选具有5至7元单环或7至10元双-或三环，其可以包含1，2或3个选自氮、氧和/或硫中的原子。“杂环基”的实例包括但不限于吗啉基，氧杂环丁烷基，硫代吗啉基，四氢吡喃基，1，1-二氧代-硫代吗啉基，哌啶基，2-氧代-哌啶基，吡咯烷基，2-氧代-吡咯烷基，哌嗪-2-酮，8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛基和哌嗪基。所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基。杂环基可以是任选取代的或未取代的。“螺杂环基”指5至18元，两个或两个以上环状结构，且单环之间彼此共用一个原子的多环基团，环内含有1个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧、硫或s(o)m的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。“螺杂环基”的非限制性实施例包括但不限于：“稠杂环基”指含有两个或两个以上环状结构彼此公用一对原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，，其中一个或多个环原子选自氮、氧、硫或s(o)m的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。“稠杂环基”的非限制性实施例包括但不限于：“桥杂环基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构，彼此共用两个不直接相连接的原子的多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧、硫或s(o)m的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。“桥杂环基”的非限制性实施例包括但不限于：“芳基”是指含有一个或者两个环的碳环芳香系统，其中所述环可以以稠合的方式连接在一起。术语“芳基”包括比如苯基、萘基、四氢萘基的芳香基团。优选芳基为6-10个碳原子芳基，更优选芳基为苯基和萘基，最优选为苯基。芳基可以是取代或未取代的。所述“芳基”可与杂芳基、杂环基或环烷基稠合，其中与母体结构连接在一起的为芳基环，非限制性实施例包括但不限于：“杂芳基”是指芳香族5至6元单环或9至10元双环，其可以包含1至4个选自氮、氧和/或硫中的原子。“杂芳基”的实施例包括但不限于呋喃基、吡啶基、2-氧代-1，2-二氢吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，3-噻二唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、1，3-二氧代-异吲哚基、喹啉基、吲唑基、苯并异噻唑基、苯并噁唑基和苯并异噁唑基。杂芳基可以是任选取代或未取代的。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，非限制性实施例包括但不限于：“烷氧基”是指(烷基-o-)的基团。其中，烷基见本文有关定义。c1-c6的烷氧基为优先选择。其实例包括，但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。“卤代烷基”指具有一个或者多个卤素取代基的烷基，其中烷基基团具有如本发明所述的含义。卤代烷基的实例包括，但并不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、全氟乙基、1,1-二氯乙基、1,2-二氯丙基等。“羟基”指-oh基团。“卤素”是指氟、氯、溴和碘。“氨基”指-nh2。“氰基”指-cn。“硝基”指-no2。“苄基”指-ch2-苯基或“bn”。“羧基”指-c(o)oh。“乙酰基”指-c(o)ch3或ac。“boc”指叔丁氧基羰基。“羧酸酯基”指-c(o)o(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基的定义如上所述。“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。本说明书所述的“取代”或“取代的”，如无特别指出，均是指基团可被一个或多个选自以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、疏基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氨基、卤代烷基、羟烷基、＝o、-c(o)(r9)、-c(o)o(r9)、-oc(o)(r9)、-n(r10)(r11)、-c(o)n-(r10)(r11)、-nr10-c(o)(r11)、-nr10-s(o)2(r11)或-so2-n(r10)(r11)，其中，r9、r10和r11的定义如通式(i)中所述。本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：s.p.parker,ed.,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；andeliel,e.andwilen,s.,"stereochemistryoforganiccompounds",johnwiley&sons,inc.,newyork,1994.本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。非对映异构体可以以其物理化学差异为基础，通过层析、结晶、蒸馏或升华等方法被分离为个别非对映异构体。对映异构体可以通过分离，使手性异构混合物转化为非对映异构混合物，其方式是与适当光学活性化合物(例如手性辅助剂，譬如手性醇或mosher氏酰氯)的反应，分离非对映异构体，且使个别非对映异构体转化为相应的纯对映异构体。本发明的中间体与化合物也可以不同互变异构形式存在，且所有此种形式被包含在本发明的范围内。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀d、l或r、s用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的原子或原子团互相连接次序相同，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50：50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。“互变异构体”或“互变异构的形式”是指不同能量的结构的同分异构体可以通过低能垒互相转化。例如质子互变异构体(即质子移变的互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮式-烯醇式和亚胺-烯胺的同分异构化作用。原子价(化合价)互变异构体包括重组成键电子的互变。除非其他方面表明，本发明所描述的结构式包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构，和几何异构)：例如含有不对称中心的r、s构型，双键的(z)、(e)异构体，和(z)、(e)的构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体，非对映异构体，或几何异构体的混合物都属于本发明的范围。本发明化合物的合成方法为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：本发明通式(i)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐的制备方法，包括以下步骤：通式(ia)化合物和通式(ib)化合物进行缩合反应，任选进一步脱去保护基pg1和pg2，得到通式(i)化合物；其中：pg1和pg2选自氨基保护基，优选为bn-o-ch2-；环a、环b、x1、x2、r1～r4、m和n的定义如通式(i)中所述。具体实施方式以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。实施例实施例给出了式(i)所表示的代表性化合物的制备及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。1hnmr图谱是用bruker仪器(400mhz)测定而得，化学位移用ppm表示。使用四甲基硅烷内标准(0.00ppm)。1hnmr的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，br＝变宽的，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为hz。质谱是用lc/ms仪测定得到，离子化方式可为esi或apci。薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层色谱法(tlc)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度，除非另有指明，各种起始原料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用，除非另有指明，市售厂家包括但不限于aldrichchemicalcompany，abcrgmbh&co.kg，acrosorganics，广赞化工科技有限公司和景颜化工科技有限公司等。cd3od：氘代甲醇cdcl3：氘代氯仿dmso-d6：氘代二甲基亚砜氩气氛是指反应瓶连接一个约1l容积的氩气气球。实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。对化合物进行纯化，采用硅胶柱层析和薄层色谱法，其中洗脱剂或展开剂体系选自：a：石油醚和乙酸乙酯体系；b：二氯甲烷和甲醇体系；c：二氯甲烷：乙酸乙酯；其中溶剂的体积比根据化合物的极性不同而不同，也可以加入少量的酸性或碱性试剂进行调节，如醋酸或三乙胺等。实施例1(s)-1-cyano-n-(1-(6-(4-fluoro-1h-pyrazol-1-yl)pyridin-3-yl)ethyl)-4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohexane-1-carboxamide1(s)-1-氰基-n-(1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酰胺1第一步tert-butyl3-((tert-butoxycarbonyl)(2-chloro-6-methylpyrimidin-4-yl)amino)-5-methyl-1h-pyrazole-1-carboxylate1b3-((叔丁氧基羰基)(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1b将2-氯-6-甲基-n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)嘧啶-4-胺1a(2.7g,12.0mmol)溶于24ml二氯甲烷中，加入二碳酸二叔丁酯(5.9g,27.2mmol),三乙胺(4.2ml,30mmol)，0℃下加入4-二甲氨基吡啶(147mg,1.3mmol)，室温反应过夜。tlc检测反应完全，加入50ml水淬灭，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到3-((叔丁氧基羰基)(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1b(3.85g,黄色固体)，产率：76％。msm/z(esi)：424.9[m+1]第二步tert-butyl3-((tert-butoxycarbonyl)(6-methyl-2-(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-7-en-8-yl)pyrimidin-4-yl)amino)-5-methyl-1h-pyrazole-1-carboxylate1ctert-butyl5-methyl-3-((6-methyl-2-(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-7-en-8-yl)pyrimidin-4-yl)amino)-1h-pyrazole-1-carboxylate1d3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸-7-烯-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1c5-甲基-3-((6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸-7-烯-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1d将3-((叔丁氧基羰基)(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1b(14.5g,34.2mmol)溶于128ml二氯甲烷与43ml水的混合溶液中，加入1,4-二氧杂-螺[4,5]癸-7-烯-8-硼酸频哪醇酯(10.0g,37.6mmol)，四(三苯基膦)钯(1.98g,1.71mmol)，碳酸钾(11.8g,85.5mmol)，100℃下反应5小时。tlc检测反应完全，反应液冷却至室温，加入100ml水淬灭，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(150ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸-7-烯-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1c(9.0g,黄色固体)，产率：50％；5-甲基-3-((6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸-7-烯-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1d(6.5g,黄色固体)，产率：45％。1c:msm/z(esi)：528.6[m+1]；1d:msm/z(esi)：428.5[m+1]；第三步tert-butyl3-((tert-butoxycarbonyl)(6-methyl-2-(1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-yl)pyrimidin-4-yl)amino)-5-methyl-1h-pyrazole-1-carboxylate1etert-butyl5-methyl-3-((6-methyl-2-(1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-yl)pyrimidin-4-yl)amino)-1h-pyrazole-1-carboxylate1f3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1e5-甲基-3-((6-甲基-2-(二噁螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1f将3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸-7-烯-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1c(9.0g,17.1mmol)，5-甲基-3-((6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸-7-烯-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1d(6.5g,15.4mmol)溶于200ml无水乙醇中，加入20％氢氧化钯(10g,14.3mmol)，氢气氛下加热至80℃反应16小时。tlc检测反应完全，反应液冷却至室温，过滤，滤饼用乙醇(50ml×2)洗涤，母液旋干，得到3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1e和5-甲基-3-((6-甲基-2-(二噁螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1f的混合物，产物不经纯化直接进行下一步反应。1e:msm/z(esi)：530.6[m+1]；1f:msm/z(esi)：430.5[m+1]第四步4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohexan-1-one1g4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-酮1g将3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(1,4-二噁螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1e与5-甲基-3-((6-甲基-2-(二噁螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-基)氨基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯1f混合物(15.5g，32.5mmol)溶于108ml二氧六环和54ml6n盐酸混合溶液中，室温反应16小时。tlc检测反应完全，旋去大部分二氧六环，用1n氢氧化钠溶液调节ph值为8-9，用乙酸乙酯(250ml×5)萃取，用饱和氯化钠溶液(250ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-酮1g(7.5g，白色固体)，产率：81％。msm/z(esi)：286[m+1]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.83(1h,s),9.58(1h,s),6.82(1h,s),6.25(1h,s),3.13(1h,m),2.35-2.15(10h,m),2.05(2h,m).第五步4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohexane-1-carbonitrile1h4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲腈1h将4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-酮1g(864mg，3mmol)溶于6ml乙二醇二甲醚和3ml叔丁醇的混合溶剂中，加入对甲基磺酰甲基异腈(708mg,3.6mmol)，0℃下分批加入叔丁醇钾(3.36g，30mmol)，0℃下搅拌5小时。tlc检测反应完全，加入50ml饱和氯化铵溶液淬灭，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲腈1h(450mg，浅黄色固体)，产率：51％。msm/z(esi)：297.4[m+1]第六步4-(4-(((benzyloxy)methyl)(1-((benzyloxy)methyl)-5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)-6-methylpyrimidin-2-yl)cyclohexane-1-carbonitrile1i4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)环己烷-1-甲腈1i将4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲腈1h(297mg,1.0mmol)溶于10ml四氢呋喃中，0℃下分批加入60％氢化钠(120mg,3.0mmol)，室温反应0.5小时，0℃下加入苄基氯甲基醚(390mg,2.5mmol)，0℃下反应2小时，tlc检测反应完全。加入50ml水淬灭，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)环己烷-1-甲腈1i(450mg,黄色固体)，产率：84％。msm/z(esi)：537.6[m+1]第七步isobutyl4-(4-(((benzyloxy)methyl)(1-((benzyloxy)methyl)-5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)-6-methylpyrimidin-2-yl)-1-cyanocyclohexane-1-carboxylate1j4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基环己烷-1-羧酸异丁酯1j氮气保护下，将4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)环己烷-1-甲腈1i(450mg,0.84mmol)溶于3ml四氢呋喃中，-78℃下加入双(三甲基硅基)胺基锂(1.7ml,1.7mmol)，-78℃下反应0.5小时，-78℃下加入氯甲酰异丁酯(232mg,1.7mmol)，室温反应2小时，tlc检测反应完全。加入30ml氯化铵溶液淬灭，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基环己烷-1-羧酸异丁酯1j(350mg,黄色固体)，产率：65％。msm/z(esi)：637.8[m+1]第八步4-(4-(((benzyloxy)methyl)(1-((benzyloxy)methyl)-5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)-6-methylpyrimidin-2-yl)-1-cyanocyclohexane-1-carboxylicacid1k4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基环己烷-1-羧酸1k将4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基环己烷-1-羧酸异丁酯1j(318mg,0.5mmol)溶于5ml四氢呋喃中，加入2.5ml2n的氢氧化钠溶液，室温反应12小时，tlc检测反应完全。减压浓缩，得到4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基环己烷-1-羧酸1k，产物不经纯化直接用于下一步反应。msm/z(esi)：581.7[m+1]第九步(s)-4-(4-(((benzyloxy)methyl)(1-((benzyloxy)methyl)-5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)-6-methylpyrimidin-2-yl)-1-cyano-n-(1-(6-(4-fluoro-1h-pyrazol-1-yl)pyridin-3-yl)ethyl)cyclohexane-1-carboxamide1m(s)-4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基-n-(1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)环己烷-1-甲酰胺1m将4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基环己烷-1-羧酸1k(290mg,0.5mmol)、(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙烷-1-胺(1l,103mg,0.5mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n””,n””-四甲基脲六氟磷酸酯(285mg,0.75mmol)、n,n-二异丙基乙胺(0.52ml,3.0mmol)溶于5mln,n-二甲基甲酰胺中，室温反应12小时，tlc检测反应完全。加入30ml水淬灭，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到(s)-4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基-n-(1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)环己烷-1-甲酰胺1m(300mg，黄色固体)，产率：78％。msm/z(esi)：769.9[m+1]第十步(s)-1-cyano-n-(1-(6-(4-fluoro-1h-pyrazol-1-yl)pyridin-3-yl)ethyl)-4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohexane-1-carboxamide1(s)-1-氰基-n-(1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酰胺1将(s)-4-(4-(((苄氧基)甲基)(1-((苄氧基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)-1-氰基-n-(1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)环己烷-1-甲酰胺1m(300mg,0.39mmol)溶于3ml乙醇和1ml乙酸的混合溶液中，加入20％的氢氧化钯(300mg)，氢气氛下加热至80℃反应72小时，tlc检测反应完全。反应液冷却至室温，过滤，滤饼用乙醇(5ml×2)洗涤，母液减压浓缩，残留物用薄层色谱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到(s)-1-氰基-n-(1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酰胺1(15mg，白色固体)，产率：7.3％。msm/z(esi)：529[m+1]1hnmr(400mhz,dmso)δ8.87(d,j＝7.4hz,1h),8.68(d,j＝4.6hz,1h),8.43(d,j＝2.0hz,1h),7.94(ddd,j＝18.4,11.3,5.4hz,3h),7.12(s,1h),6.65(s,1h),5.15-4.90(m,1h),2.81(s,1h),2.40(s,3h),2.35-2.26(m,2h),2.22(s,3h),2.10(s,2h),2.03-1.89(m,4h),1.48(t,j＝8.2hz,3h).实施例2n-((s)-1-(6-(4-fluoro-1h-pyrazol-1-yl)pyridin-3-yl)ethyl)-4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohex-1-ene-1-carboxamide2n-((s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-甲酰胺2第一步tert-butyl3-((tert-butoxycarbonyl)(6-methyl-2-(4-oxocyclohexyl)pyrimidin-4-yl)amino)-5-methyl-1h-pyrazole-1-carboxylate2a3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(4-氧代环己基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯2a将4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-酮1g(6.0g，21.0mmol)溶于42ml二氯甲烷中，加入二碳酸二叔丁酯(10.3g,47.3mmol),三乙胺(7.3ml,52.5mmol)，0℃下加入4-二甲氨基吡啶(256mg,2.1mmol)，室温反应16小时。tlc检测反应完全，加入100ml水淬灭，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(100ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(4-氧代环己基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯2a(8.8g，黄色固体)，产率：87％。msm/z(esi)：486.6[m+1]第二步4-(4-((1-(tert-butoxycarbonyl)-5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)-6-methylpyrimidin-2-yl)cyclohex-1-ene-1-carboxylicacid2b4-(4-((1-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-羧酸2b将3-((叔丁氧基羰基)(6-甲基-2-(4-氧代环己基)嘧啶-4-基)氨基)-5-甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯2a(8.8g，18.1mmol)溶于17.3ml溴仿中，冷却至0℃慢慢滴加氢氧化钾(8.08g,2.1mmol)的甲醇溶液(45ml)，滴加完毕，升至室温反应16小时。tlc检测反应完全，向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(100ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到的残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到4-(4-((1-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-羧酸2b(800mg，白色固体)，产率：10％。msm/z(esi)：414.5[m+1]第三步4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohex-1-ene-1-carboxylicacid2c4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-羧酸2c将4-(4-((1-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)-6-甲基嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-羧酸2b(214mg，0.5mmol)溶于5ml四氢呋喃中，加入2.5ml2n的氢氧化钠溶液，升至60℃反应12小时。tlc检测反应完全，反应液减压浓缩，得到4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-羧酸2c，产物不经纯化直接进行下一步反应。msm/z(esi)：314.3[m+1]第四步n-((s)-1-(6-(4-fluoro-1h-pyrazol-1-yl)pyridin-3-yl)ethyl)-4-(4-methyl-6-((5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino)pyrimidin-2-yl)cyclohex-1-ene-1-carboxamide2n-((s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-甲酰胺2将4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-羧酸2c(157mg,0.5mmol)、(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙烷-1-胺1l(103mg,0.5mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n””,n””-四甲基脲六氟磷酸酯(285mg,0.75mmol)、n,n-二异丙基乙胺(0.52ml,3.0mmol)溶于5mln,n-二甲基甲酰胺中，室温反应12小时，tlc检测反应完全。加入30ml水淬灭，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，用饱和氯化钠溶液(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析法(洗脱剂：a体系)纯化，得到n-((s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-1-烯-1-甲酰胺2(55mg，黄色固体)，产率：22％。msm/z(esi)：502[m+1]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.91(s,1h),9.56(s,1h),8.67(d,j＝4.5hz,1h),8.43(d,j＝2.1hz,1h),8.24(d,j＝7.8hz,1h),8.09-7.78(m,3h),6.84(s,1h),6.69(s,1h),6.15(s,1h),5.10(p,j＝7.0hz,1h),3.17(d,j＝5.1hz,1h),2.75(d,j＝16.7hz,1h),2.54-2.45(m,3h),2.25(s,3h),2.18(s,3h),2.07(d,j＝12.4hz,1h),1.69(ddd,j＝23.0,11.5,5.3hz,1h),1.46(d,j＝7.1hz,3h).生物学评价测试例1、本发明化合物对ret异常肿瘤细胞(tt细胞)增殖抑制活性的测定以下方法用于测定本发明优选化合物在体外条件下对tt细胞的增殖抑制活性。tt细胞为人甲状腺髓样癌细胞株，该细胞株含retc634w突变，细胞株购于美国atcc(货号crl-1803)。该细胞使用ham'sf-12k(kaighn's)培养基(购于thermofisher，gibco，货号21127022)附加10％胎牛血清(fbs,购于thermofisher，gibco，货号12483-020)，1xglutamax(购于thermofisher，gibco，货号35050061),1xnon-essentialaminoacids(购于thermofisher，gibco，货号11140050),1xpen/strepantibiotics(购于thermofisher，gibco，货号15140122)在37℃，5％浓度co2条件下进行培养。细胞活性通过采用promega公司的celltiter-luminescentcellviabilityassay(货号g7573)方法进行检测。实验方法简述如下：正式实验前日，将处于对数生长期的细胞用胰酶(trypsin，购于thermofisher，gibco，货号25300054)消化处理，随后加入适宜体积的培养基终止胰酶反应。以1000转/分速度离心后，吸去上层培养基，并加入新的培养基配成细胞悬液。向96孔细胞培养板(购于corning，货号3904)中加入50ul细胞悬液，每孔细胞密度为6000个/孔。随后将培养板在37℃，5％浓度co2条件下培养过夜。实验当日，首先将测试化合物溶解于dmso(sigma-aldrich，货号v900090)中配制为贮存液，随后用dmso按1：3比例进行连续稀释，共计9个浓度点，同时设dmso对照。随后另取一块96孔培养板，向各孔中加入250ul不含血清的f12培养基，再向各孔中加入0.5ul各浓度化合物溶液，振荡混匀，配制成测试样品。之后从各孔中取50ul测试化样品溶液加入至细胞板中，最终化合物的测试浓度范围为10000nm至1.52nm，每个浓度含复孔对照。将细胞板在37℃，5％浓度co2条件下连续培养8天。培养结束后，向各孔中加入50ulcelltiter-glo试剂，振荡混匀后在室温下避光孵育10分钟，随后在envision酶标仪(perkinelmer)上读取各孔信号。随后在graphpadprism软件中以化合物浓度对数-信号强度进行非线性回归分析，得到测试化合物抑制细胞增殖的ic50值。表1本发明中化合物对tt细胞增值活性抑制ic50实施例编号ic50(nm)/tt138.7233.9测试例2、本发明化合物对ret酶抑制活性的测定1、实验材料试剂名称供货商货号gst-hret激酶(658-1114)carna08-159htrfkinease-tkkitcisbio62tk0pec5x酶反应缓冲液cisbio62ezbfdctksubstrate-biotincisbio61tk0blesebcisbio61sebalfultrapureatppromegav915atkantibody-cryptatecisbio—streptavidin-xl665cisbio610saxladetectionbuffercisbio62sdbrdd384孔板perkinelmer60072902、试剂准备(1)1x酶反应缓冲液:超纯水4：1稀释5x酶反应缓冲液，加入25nmseb。(2)5xret激酶：1x酶反应缓冲液稀释ret激酶到2.5nm(3)5xatp：1x酶反应缓冲液稀释atp到50um(4)5x底物：1x酶反应缓冲液稀释tksubstrate-biotin到2500nm(5)2.5x化合物：终浓度最高浓度为2500nm，3倍梯度稀释，10个稀释点，dmso终浓度为0.4％(6)4xsteptavidin-xl665：1x酶反应缓冲液稀释steptavidin-xl665到250um3、实验过程(1)384多孔板中加入2ul/孔5xret激酶(终浓度0.5nm)，设定空白组(酶反应缓冲液)作为阴性对照(2)加入4ul/孔2.5x化合物梯度，室温孵育30分钟，设定dmso组作为阳性对照(3)加入2ul/孔5x底物(终浓度500nm)和2ul/孔5xatp(终浓度10um)起始反应，室温反应30分钟(4)加入5ul/孔tkantibody-cryptate和5ul/孔4xsteptavidin-xl665(终浓度62.5um)，室温孵育60分钟(5)envision读取htrf信号4、数据分析用graphpadprism软件对化合物的剂量效果(ic50)进行分析表2本发明中化合物对ret酶活性抑制ic50实施例编号ic50(nm)23.2结论：本发明化合物对ret酶活性具有明显的抑制作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12