本发明属于基因和蛋白的功能与应用领域，涉及肝癌缺失基因3(dlc3)的新用途，特别是涉及dlc3作为胃癌预后标志物的新应用。
背景技术：
：肝癌缺失基因3(deletedinlivercancer-3，dlc3)dlc3是dlc家族的一个成员。dlc家族被认为是一类抑癌基因，但其成员之一dlc3目前鲜有研究。理论上，dlc3具有能使rhogtpase失活的结构域，rhogtpase的激活能触发一系列下游信号促进肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，emt)。既往文献也有报道dlc3在多种肿瘤表达下调，进而活化rhoa。然而，目前无论是dlc3在胃癌中的临床预后意义，还是dlc3与代谢应激或emt的关系均不清楚。emt被认为是上皮起源的恶性肿瘤细胞浸润和转移的起始步骤之一，也是目前胃癌领域的研究热点。发生emt的胃癌细胞将从原本相互粘附紧密的癌巢组织中脱离出来，形成单个的、非极性的、可移动的纺锤形细胞。emt的形成需要细胞间连接断裂，细胞骨架重排，并伴随细胞外基质的降解。目前，代谢应激和emt的关系尚不完全清楚，有必要进一步探索它们之间的调控网络。技术实现要素：本发明的目的在于提供dlc3在制备用于胃癌预后的试剂盒中的用途。根据本发明所述的用途的进一步特征，所述试剂盒是根据样品中dlc3的含量或含量的变化趋势来判断胃癌预后的情况。优选地，所述的试剂盒为蛋白表达量检测试剂盒。进一步优选地，所述的试剂盒为免疫组化或免疫荧光检测试剂盒。优选地，所述的试剂盒为pcr检测试剂盒。本发明首次揭示了：在胃癌中dlc3下调，dlc3低表达的胃癌更容易复发，总生存时间也更短。进一步研究机制，揭示了胃癌转移和能量代谢的关系，并发现了如下的信号通路：代谢应激通过抑制dlc3表达，从而引起rhoa/rock/jnk/ap-1信号通路的激活，并促进结肠癌转移相关基因-1(metastasis-associatedincoloncancer-1，macc1)表达。dlc3/macc1轴通过调控葡萄糖代谢以及细胞运动能力，影响胃癌细胞的能量趋化。本发明从临床现象，到细胞功能，再到分子机制，揭示了dlc3促进胃癌转移的作用，并以dlc3为结点探讨了胃癌转移的机制。因此，可以将dlc3作为胃癌预后的标志物，并制备用于胃癌预后的试剂盒。附图说明图1显示dlc3抑制胃癌细胞增殖和迁移。图2为动物实验结果图，显示dlc3低表达促进胃癌转移，影响葡萄糖代谢。图3显示dlc3/macc1轴共同影响胃癌预后。图4显示dlc3负调控macc1表达。图5显示dlc3/macc1轴通过调控胃癌细胞代谢，影响能量趋化。具体实施方式一、实验材料组织标本：胃癌及癌旁组织qrt-pcr标本通过手术从12例胃癌患者中获得，取材时间为2015年2月；石蜡包埋标本通过手术切除从90例胃癌患者中获得的，取材时间为2015年。所有纳入的患者均依照uicc/ajcc2010标准进行临床病理分期：19例为胃癌i期，37例为胃癌ⅱ期，34例为胃癌iii期。标本用10％福尔马林固定，石蜡包埋、切片。所有患者均经根治性手术切除肿瘤病灶，且在取材前均未接受过任何抗肿瘤治疗。主要仪器：spectramax5多功能酶标仪购自moleculardevices公司(美国)，odyssey成像系统购自li-cor公司，lightcycler480购自roche，倒置显微镜、正置显微镜购自olympus，facscantoii流式系统购自bdbiosciences。主要试剂及耗材：胎牛血清、1640培养基购自hyclone公司，2000×pbs粉末购自biosharp公司。edta、无edta胰酶为solarbio公司生产，tris-hcl(ph8.8及ph6.8)购自上海白赛生物技术有限公司，temed、30％聚丙烯酰胺、过硫酸铵、10％sds等制备凝胶的试剂购自biosharp公司。tris碱购自biosharp公司。甘氨酸、sds粉末为sigma公司生产。甲醇、异丙醇、无水乙醇、三氯甲烷、吐温为广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产。脱脂奶粉采购自biosharp公司。2000×tbs粉末、一抗稀释液购自biosharp公司。全蛋白提取试剂盒为南京凯基生物有限公司生产。5×蛋白上样缓冲液购自杭州弗德生物科技有限公司。兔单克隆e-cadherin、vimentin和gapdh购自cellsignaltechnology，兔多克隆抗dlc3抗体购自proteintech公司，兔单克隆抗macc1抗体购自abnova公司，兔单克隆抗ki-67抗体购自cellsignalingtechnology公司，羊抗兔二抗为li-cor公司生产。二甲苯、枸橼酸钠缓冲液，过氧化氢溶液、dab工作液、苏木素、盐酸、中性树胶购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心。各型号细胞培养皿、6孔板、12孔板、96孔板为康宁公司生产。transwell小室购自康宁公司。bca蛋白浓度测定试剂盒为江苏碧云天生物公司生产。trizolkit购自takara，cdna合成逆转录试剂盒购自takara。sybrgreenimaster试剂盒购自takara。凋亡检测试剂盒为三箭生物生产。ros检测试剂盒为江苏碧云天生物公司生产。edu试剂盒为锐博生产。mtt购自sigma公司。二甲基亚砜购自广州华大公司。重组慢病毒购自吉凯公司。二、实验方法1.免疫组化染色烤片：切片在65℃烤片机上烤片3小时。脱蜡：经二甲苯浸泡两次，每次10分钟后，依次经100％酒精、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精浸泡3分钟脱蜡，最后浸入pbs溶液洗涤3次，每次5分钟。抗原修复：配置枸橼酸盐溶液2000ml置于高压锅中，将切片置于切片架上并放入枸橼酸盐溶液中，电磁炉加热至高压锅喷气开始计时，3分钟后停止加热并将高压锅置于冷水中冷却至恢复室温。取出切片经pbs溶液洗涤3次，每次3分钟。内源性过氧化物酶灭活：切片于3％过氧化氢溶液中浸泡10分钟，继续用pbs溶液洗涤3次，每次3分钟。封闭：滴加5％bsa室温孵育组织1小时孵一抗：滴加一抗于组织上，置于湿盒中于4℃冰箱中孵育过夜。复温：次日将湿盒转移至常温环境1小时后，用pbs溶液洗涤切片5次，每次3分钟。孵二抗：滴加相应种属源性二抗于组织上，室温孵育1小时，继续用pbs溶液洗涤切片5次，每次5分钟。dab显色：按dab浓缩液：dba底物缓冲液＝1：20配置dab溶液，滴于组织上，显色3-10分钟后浸入清水中终止显色。苏木素染色：将显色后的切片置于苏木素溶液中染色10～15分钟后，在自来水下流水冲洗约10min。分化反蓝：再将切片置于浓度为l％盐酸酒精中浸泡2秒，迅速转入自来水下流水冲洗约5分钟，于显微镜下观察细胞核染色情况，若不明显可重复苏木素染色及后续冲洗、分化的步骤。透明：将染好后的组织切片依次置于70％、80％、90％、95％酒精溶液中浸泡2分钟，100％酒精浸泡约10分钟，最后浸泡于二甲苯中10min。封片、拍照：待透明后的组织切片于通风处自然风干后用吸管吸取中性树脂滴在组织上，盖上盖玻片，室温下放置1-2天后树脂凝固，将蜡片置于正置显微镜下观察、拍照。评价标准：染色深度共分为0分(无色)、1分(淡黄色)、2分(黄色)、3分(棕黄色)，每种染色所占面积则依照0分(0％)、1分(1％-25％)、2分(26％-50％)、3分(51％-75％)或4分(76％-100％)进行评分。染色深度评分和对应的染色面积评分相乘后相加，既得到了最后的染色评分。其中0-2分定义为阴性表达，3-5分定义为弱阳性表达，6-12分定义为强阳性表达。2.mtt实验种板：按实验需要设置空白组、阴性对照组、实验组，每组设置5个复孔。将细胞消化、离心后获得沉淀，加入完全培养基重悬细胞并计数，按2000个/孔密度种植于96孔板中，每孔中液体体积不超过200ul，在37℃孵箱中培养。处理：培养过夜后按实验分组分别处理细胞后继续放于37℃孵箱中培养。0.5％的mtt原液与不含胎牛血清的rpmi-1640培养基按1：9配成mtt工作液。将96孔板中细胞上清吸去后加入mtt工作液200ul，于37℃孵箱中避光孵育3h，吸去上清，每孔加入150ul二甲基亚砜，室温震荡10min至沉淀溶解后，使用酶标仪测定各孔在490nm波长处的od值。3.平板克隆实验种板：将细胞消化、离心后获得沉淀，加入完全培养基重悬细胞，按每孔2ml完全培养基、1000个细胞计算出需要的培养基体积及细胞数，充分混匀后吸取相应的含细胞的完全培养基种于6孔板中，置于37℃孵箱培养。处理：贴壁后按实验需要处理各孔中的细胞。固定：培养14天后吸去上清，用pbs洗3次，加入4％多聚甲醛固定细胞30min。染色：固定后的细胞用pbs洗涤3次，加入0.1％结晶紫溶液1ml染色30min，清水洗去浮色，置于干燥通风处晾干，相机拍照。4.活性氧检测铺板：将细胞消化、离心后得到沉淀，加入完全培养基重悬细胞，按每孔200ul完全培养基、2000个细胞计算出需要的培养基体积及细胞数，充分混匀后吸取相应的含细胞的完全培养基种于96孔板中，置于37℃孵箱培养过夜。处理：次日按实验需要处理相应的细胞。加载探针：按照dcfh-da:无血清培养液＝1:1000稀释dcfh-da。去除细胞培养液，每孔中加入100ul稀释好的dcfh-da，于37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。检测：使用荧光倒置显微镜观察、拍照。5.细胞凋亡检测消化、离心：按实验需要予以细胞相应处理后，用不含edta的胰酶将细胞消化、离心后去除上清，加入pbs洗涤后再次离心，留取沉淀。按照纯水|：10×bindingbuffer＝9：1配置bindingbuffer。每管细胞加入1ml配置好的bindingbuffer，洗涤后按300g10min离心，去除上清。用bindingbuffer将细胞浓度调整至1×106/ml，并吸取100ul细胞悬液置于样品管中。染色：每管加入5ulannexinv-fitc溶液，室温避光孵育10min后，每管加入5ulpi溶液，室温避光孵育5min。检测：染色后的样品每管加入500ulpbs后重悬，于1h内用流式细胞仪检测样品。7.侵袭实验铺胶：用无血清的rpmi-1640培养基将matrix原液稀释为10％matrix溶液。在上室加入100ul10％matrix溶液，枪头提前在4度冰箱冷却过夜。于37℃孵箱孵育2h至溶液凝固为凝胶。铺板：将细胞消化、离心后得到沉淀，加入不含胎牛血清的rpmi-1640培养基重悬细胞，按每孔200ul完全培养基、1×105个细胞计算出需要的培养基体积及细胞数，充分混匀后吸取相应的细胞悬液铺种于上室的基质胶表面，下室加入含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基，于37℃孵箱培养24-48小时。固定：48h后取出小室并吸去上室液体，使用4％多聚甲醛固定穿过膜的细胞30min。染色：使用0.1％结晶紫溶液染色30min。结果用倒置显微镜观察、采集。8.细胞划痕实验铺板：将细胞消化、离心后得到沉淀，加入含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基重悬细胞，将细胞按5×105/孔密度种入6孔板中，置于37℃孵箱培养。划痕：待细胞长满皿底后用200ul枪头垂直皿底划出划痕，用pbs润洗皿底洗去漂浮的细胞，加入含有2％胎牛血清的rpmi-1640培养基进行培养。观察：分别于0h、24h、48小时使用倒置显微镜观察划痕愈合情况，拍摄采集。9.荧光定量pcr9.1rna的提取提前半小时预冷离心机。弃去待提rna的细胞的上清液，用吸管吸取适量预冷的pbs溶液加入贴壁的细胞中，轻轻摇晃数次后弃去溶液，重复3次，最后一次需用移液枪彻底吸净pbs。加入lmltrizol溶液，轻轻摇晃使trizol溶液均匀覆盖整个皿底，将细胞置于4℃摇床上慢摇。约20-30min后，用移液枪吸取裂解液反复吹打细胞生长面，把液体转移至1.5ml去rna酶的ep管内。向ep管中加入1/5裂解液体积(200u1)的三氯甲烷(氯仿)，上下轻轻颠倒震荡lmin，室温静置5min。将ep管置于微量低温离心机中，12000rpm4℃离心15min。离心完成后，用移液枪小心缓慢地吸取350ul体积上层透亮的液体(余下的弃去)，注入新备的1.5ml容量的去酶ep管中，再往该管中继续加入等体积的异丙醇溶液(350u1)，盖上ep管盖后反复颠倒混匀约1min，然后静置约10min。将ep管置于低温离心机中，12000rpm4℃离心10min。离心后弃去上层液体，加入1ml预冷的75％乙醇(无水乙醇：depc水＝3：1配制)清洗沉淀。于低温离心机中，12000rpm4℃离心5min。用移液枪小心缓慢吸取上层液体并弃去，避免触碰到沉淀，再用滤纸谨慎地吸取遗留在管壁的微量液体，最后置于生物安全柜内吹干沉淀。待肉眼沉淀变成透明胶冻样，往ep管底加入5～15ul去rna酶水溶解沉淀。使用分光光度计测定所提标本rna的纯度及浓度。首先吸lul去离子水标准调零，然后吸lul所提取的rna样本，测定结果。当入260/280比值数值大于1.8时，则纳入研究可继续下一步的实验，否则弃去所提的rna标本，重新提取。记录所有样本测得的rna的浓度及纯度，标记好样本的名称及提取时间，放置予80℃冰箱可保存半年。9.2逆转录步骤逆转录使用日本takara的逆转录试剂盒，将合格的rna立即逆转录成cdna。其反应体系为10ul，如下：去rna酶水7ul5×primescriptrtmastermix2ulrna1ul将所提的rna样本用去离子水将浓度均稀释到500单位左右，然后每个逆转录体系加入该rna样本1ul，然后计算需要加入将整个体系补齐到10ul的去离子水的体积。按顺序和剂量依次加入相应试剂于去rna酶的ep管中，稍微瞬时离心让所有液体聚集于ep管的管底，禁止出现气泡。马上放入逆转录机器中，设定“37℃15min，85℃3s，4℃无限”的条件进行反应。在逆转录完成后，分别往每个小ep管中加入30ul去酶水稀释混匀后置于4℃冰箱冷藏备用。实验中所用引物序列如下：9.3qrt-pcr根据下表加入反应体系(10ul)所需要的试剂，进行qrt-pcr：去rna酶水3.6ul上游引物0.2ul下游引物0.2ultaq酶5ulcdna1ul按照待测基因分别准备相应的ep管，根据上表前四种试剂分别配好，加入taq酶后所有步骤都要避光。将每个ep管内的液体瞬时离心，使其混合均匀然后用微量移液枪精确地吸取9ul，沿pcr扩增板的孔壁完全打入，每个均设3个复孔，再往每个孔加入相应的1ul稀释后的cdna，保证加入量精确。最后用pcr板专用贴膜紧贴板上，保证完全覆盖每个上样孔，然后于离心机中1000rpm5min离心，最后将pcr板放入roche定量荧光pcr仪中，上机检测，选择特定的扩增程序，等待电脑输出结果。10.免疫荧光染色种皿：将细胞消化、离心后去除上清，用完全培养基将细胞密度调整至1×105个/ml，并吸取1ml细胞悬液接种细胞于共聚焦专用皿，仔细摇匀细胞，置于37℃培养箱培养。按实验需要处理细胞后，用滤过后的pbs溶液清洗细胞2次，每次5min。加入4％的多聚甲醛溶液400ul固定细胞30min。加入pbs清洗3遍，每遍5min。加入400ul过滤pbs配置的0.5％曲拉通x-100，室温破膜10min。继续加入pbs洗涤3次，每次5min。加入5％bsa溶液400ul室温封闭30min。加入5％bsa配制的一抗工作液，于4℃冰箱孵育过夜；e-cadherin、vimentin、macc1及dlc3一抗稀释比例根据产品说明书调整。次日取出细胞，室温静置复温1h后吸去一抗工作液，加入pbs洗涤5次，每次3min。加入相应种属源性的荧光二抗工作液，室温避光孵育1h。弃去二抗工作液，加入pbs洗涤5次，每次3min。加入500ul5ug/mldapi溶液，室温静置染色10min。加入pbs洗涤5次，每次3min。最后加入400ul的pbs溶液以保持皿底湿润，共聚焦显微镜下观察并采集图像。11.动物实验动物实验用到的balb/c裸鼠均为4周龄，雄性，购自南方医科大学动物实验研究中心。11.1小鼠皮下瘤模型将裸鼠按实验设计随机分组，每组至少5只。将细胞消化后用pbs洗涤沉淀，并以1000rpm离心3min，重复三次。将去除了血清的细胞制备成1×108个/ml的细胞悬液，取100ul细胞悬液于小鼠右后肢根部行皮下注射。自接种皮下瘤后第6天起，每2日测量小鼠肿瘤的最长径(l)与最短径(w)，并计算肿瘤体积v(cm3)＝(l×w2)/2，制得皮下瘤的生长曲线。皮下成瘤30天后，脱颈法处死裸鼠，收集皮下瘤体组织，称重并且拍照记录。11.2肺转移模型将裸鼠按实验设计随机分组，每组至少5只。将细胞消化后用pbs重悬细胞沉淀，并以1000转/min离心3min后去除上清，重复三次。将去除血清的细胞制备成5×107个/ml的细胞悬液。将小鼠尾巴浸泡在预先准备的温水中1min，尾部血管扩张后装小鼠入固定器，使尾巴暴露于固定器外。予酒精棉球消毒尾部，取100ul细胞悬液于小鼠尾静脉缓慢注入，4周后处死小鼠，收集、固定小鼠肺组织并拍照记录。11.3肝转移模型裸鼠按实验设计随机分组，每组至少5只。将细胞消化后用pbs重悬细胞沉淀，并以1000转/min离心3min后去除上清，重复三次。将去除血清的细胞制备成6×107个/ml的细胞悬液。小鼠取右侧卧位，于左肋弓下缘作一约0.8cm皮肤切口，逐层剪开筋膜及肌肉，用无齿镊将小鼠脾脏轻轻夹取、拉出暴露于体腔外，用胰岛素针抽取100ul细胞悬液，自脾脏下缘末端平行进针约0.3-0.5cm，缓慢推注细胞。注射完后予酒精棉签压迫脾脏进针处一分钟，再予手术缝线缝合切口。术后第二日起予洛伐他汀100mg/kg体重灌胃，4周后处死小鼠，收集、固定小鼠肝脏及脾脏组织并拍照记录。实施例一：dlc3低表达促进胃癌细胞增殖和迁移为了明确dlc3在胃癌细胞中的作用，发明人利用人mkn45胃癌细胞构建了dlc3过表达和沉默的胃癌细胞模型。过表达dlc3明显抑制胃癌细胞活性(图1a)、dna合成(图1b)和克隆形成能力(图1c)。相反，抑制dlc3表达明显促进上述生物学过程。表明dlc3负性调控胃癌细胞的增殖能力。意想不到的是，发明人还发现，dlc3还能影响胃癌细胞的形态。当过表达dcl3后，细胞缩成小球状，细胞长径和短径比值明显下降(图1d)。反之，当沉默dlc3后，细胞变成长梭形纺锤状，细胞长径和短径比值明显增大(图1d)。这说明dlc3参与细胞骨架和极性的调节，也提示dlc3很可能参与细胞运动的调节。在细胞运动功能方面，发明人进行了划痕实验(图1e)和transwell实验(图1f)进行验证。过表达dlc3明显抑制胃癌细胞迁移和侵袭，而沉默dlc3促进胃癌细胞迁移和侵袭。接着，在分子表型方面，发明人也做了同样的验证，过表达dlc3促进胃癌细胞向上皮表型转化，而沉默了dlc3促进了胃癌细胞向间充质表型转化(图1g)。实施例二：动物实验证明dlc3低表达促进胃癌转移，影响葡萄糖代谢在细胞模型的基础上，发明人进一步进行动物实验的验证。将胃癌移植瘤接种在裸鼠皮下(图2a)，沉默dlc3明显抑制胃癌移植瘤的生长速率(图2b)。在第34天取移植瘤进行测量，无论是大小和重量(图2c)，还是组织ki-67表达情况(图2d)，沉默dlc3都明显较对照组生长旺盛。在转移能力方面，发明人进行了尾静脉注射肺转移瘤模型和脾脏注射肝转移模型进行验证。通过裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞，发现macc1沉默组的转移灶数目明显较对照组高(图2的e和g)，而且肺转移的发生率(图2f)也明显高于对照组。通过脾脏注射肝转移模型，发现macc1沉默组在脾脏原位的生长速率明显高于对照组(图2h)，并且肝脏和腹膜发生转移的概率也大大增加(图2的i和k)。更有趣的是，通过小动物pet/ct成像，发现dlc3沉默组转移灶的葡萄糖代谢是明显增强的(图2h)，提示dlc3还有可能影响胃癌细胞葡萄糖代谢。实施例三：dlc3/macc1轴共同影响胃癌预后为了了解dlc3和macc1的关系，发明人进行生物信息学分析。tcga胃癌数据分析结果结果显示dlc3和macc1呈明显负相关关系(图3a)。发明人进一步在南方医院收集i-iii期胃癌根治术后的临床患者标本进行检测，免疫组化分析结果也提示macc1和dlc3在蛋白表达上表现出负相关关系(图3b)，并且随着疾病分期递增，dlc3阴性的患者比例也逐渐升高(图3c)。在dlc3阴性的患者中，macc1阳性表达的比例更高(图3d)，并且dlc3阴性和macc1阳性的患者中复发的风险更高(图3的e和f)。在生存随访方面，dlc3阴性、macc1阳性表达的胃癌患者无复发生存期短，而dlc3阳性、macc1阴性的患者无复发生存期更长。这表明dlc3/macc1轴共同影响胃癌预后。实施例四：dlc3通过rhoa/jnk/ap-1转录调控macc1为了明确macc1和dlc3上下游的关系，发明人对dlc3进行沉默后发现macc1的mrna表达(图4a)和蛋白表达(图4b)明显增高。通过既往文献推测rhoa/jnk/ap-1可能是潜在调控macc1表达的通路。针对通路上的分子，分别加入rhoa、rock、jnk的抑制剂，发现macc1的mrna表达明显下调(图4c)。在蛋白水平，在沉默dlc3的基础上加入上述抑制剂后，沉默dlc3所引起的macc1上调被有效阻断(图4d)，表明dlc3通过rhoa/jnk/ap-1负性调控macc1转录。在细胞功能方面，沉默dlc3引起的克隆形成增多(图4e)和侵袭能力增强(图4f)可有效呗jnk抑制剂所阻断。表明dlc3通过是rhoa/jnk/ap-1影响下游生物学效应的。实施例五：dlc3/macc1轴通过调控胃癌细胞代谢，影响能量趋化通过edu实验发现，在过表达macc1后，原本由过表达dlc3引起的胃癌增值抑制被部分逆转了(图5a)。过表达dlc3后葡萄糖摄取的能力下降，在此基础上过表达macc1后，葡萄糖摄取部分恢复(图5b)。此外，从细胞上清的培养基颜色和ph值可以看出，dlc3抑制酸性物质生成，macc1过表达能使酸性物质增加(图5c)。这提示dlc3/macc1轴影响胃癌细胞的葡萄糖酵解。受到细胞代谢的影响，在胃癌细胞在活性氧生成和代谢应激引起的凋亡两方面，dlc3/macc1轴均显示出调控作用(图5d-e)。此外，发明人还发现dlc3/macc1轴能影响胃癌细胞的迁移和侵袭(图5f-g)。综上，考虑到dlc3/macc1轴同时影响胃癌代谢和细胞运动，可推测dlc3/macc1轴也可能影响胃癌细胞的能量趋化效应。通过transwell实验，上室以葡萄糖剥夺模拟代谢应激，下室以高糖模拟能量供应充足的状态。结果符合预期，dlc3/macc1轴通过调控代谢，影响胃癌细胞从无糖向高糖的能量趋化效应。实施例六：洛伐他汀通过调控dlc3/macc1轴抑制胃癌进展既往文献报道洛伐他汀可以抑制macc1转录，本实施例研究洛伐他汀能否影响macc1上游的dlc3表达。通过实验发现，胃癌细胞加入不同浓度的洛伐他汀刺激后，dlc3的mrna随着浓度梯度表达逐渐增高，而macc1的表达逐渐下降。在蛋白水平也证实了洛伐他汀能够促进dlc3并抑制macc1。接着，通过脾脏接种肝转移模型在在体水平证实洛伐他汀能够抑制种植灶肿瘤生长，并抑制肝转移的发生。肿瘤组织的dlc3和macc1的免疫组化染色结果也显示，洛伐他汀促进dlc3表达，抑制macc1表达。在洛伐他汀刺激下沉默dlc3，原本被抑制的细胞的侵袭能力和克隆形成能力被部分恢复了；代谢应激引起的细胞凋亡得到部分缓解。综上，考虑到dlc3/macc1轴同时影响胃癌代谢和细胞运动，可推测dlc3/macc1轴也可能影响胃癌细胞的能量趋化效应。通过transwell实验，上室以葡萄糖剥夺模拟代谢应激，下室以高糖模拟能量供应充足的状态。结果符合预期，dlc3/macc1轴通过调控代谢，影响胃癌细胞从无糖向高糖的能量趋化效应。因此，作为rhoa上游抑制性分子，dlc3可能通过影响macc1在肿瘤代谢和转移中扮演重要角色，进而影响胃癌预后。因此，可以将dlc3作为胃癌预后的标志物，并制备用于胃癌预后的试剂盒。根据上述实验结果，可以制备为蛋白表达量检测试剂盒，优选是免疫组化或免疫荧光检测试剂盒，也可制备为pcr检测试剂盒。当前第1页12