本发明涉及一种石油降解菌剂的制备方法，属于石油污染修复
技术领域：
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背景技术：
：随着石油开采量的日益增大，在开采、运输、储藏以及事故性泄露中，石油大量进入环境，严重污染了土壤、地下水、河流和海洋。采用微生物修复石油污染的土壤，是一项清洁环境的低投资、高效益、便于应用、发展潜力大的新兴技术。石油在生产、加工及使用过程中，由于不正常操作、事故及检修等原因，会有石油烃类的溢出和排放，造成了石油对环境的污染，修复污染迫在眉睫。微生物修复技术是一种高效、安全、低成本的石油污染修复技术，但游离微生物在实际污染环境中易受外界因素影响，降解作用难以充分发挥。为了消除石油的污染，修复石油污染经历了相当长的技术革新和研究，人们对石油污染的修复方法做了大体分类，主要有物理法，化学法和生物法。物理法是采用物理方法修复石油污染，包括：气浮法，膜分离法，吸附法，热处理法（焚烧法）换土法、隔离法等。吸附法是最常用的物理法之一，是利用具有多孔性的固体物质，达到一种或多种物质从液相中迁移到固相表面的效果。活性炭一般为物理吸附载体的选择。物理法还包括化学絮凝法，化学氧化法，电化学法。对污染土壤进行生物修复，主要是指利用特定的生物（植物、微生物或原生动物）通过生物自身的生长和代谢过程，移除、降解或转化有害物质为无害物质，降低污染度，恢复良好的环境和生态效应。常用的生物修复方法主要有一下几种：（1）微生物修复，微生物修复主要是将石油作为生长所需的营养物质，将石油进行降解。微生物修复分原位生物修复和异位生物修复。（2）植物修复，植物修复技术是利用植物的根以及植物体内的酶对污染的环境进行治理的方法。（3）植物-微生物联合修复，在实际的生物修复中，植物-微生物联合体系可以促进石油的快速降解、矿化。石油污染土壤的生物修复技术生产费用低、不产生二次污染，是一项具有广阔前景的高新技术。因此，如何利用生物修复石油污染土壤成为国内外研究人员积极探索解决的重要课题。土壤中本身存在一些可以降解石油的土著微生物，它们是人们获取生物修复土壤的主要微生物来源。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题：针对现有石油降解菌剂保存时间有限的问题，提供了一种石油降解菌剂的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：（1）将新鲜柚子皮破碎，并置于温度为90～100℃的烘箱中干燥至恒重，即得破碎柚子皮，将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理，冷却至室温，研磨并过30～50目筛，即得混合物；（2）将石油降解菌接入种子培养基，培养处理，即得种子液，在种子液中加入固体培养基，培养处理，即得菌液；（3）将混合物和菌液混合，进行抽真空处理，过滤即得滤渣；将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理，冷却至室温，即得混合溶液，在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理，冷却至室温，即得石油降解菌剂。步骤（1）所述的将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理步骤为：按质量比1∶1将破碎柚子皮和活性炭混合，在温度为300～400℃的马弗炉中热解3～4h。步骤（2）所述的石油降解菌的制备步骤为：按质量比1∶1将枯草芽孢杆菌和假单胞菌混合，即得石油降解菌。步骤（2）所述的种子培养基的组分和制备步骤为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节ph值为7.0，在温度为121℃下灭菌20min。步骤（2）所述的固体培养基的组分和制备步骤为：蔗糖10g，草炭10g，牛肉膏6g，酵母粉1.5g，蒸馏水1000ml，在温度为121℃下灭菌20min。步骤（2）所述的将石油降解菌接入种子培养基，培养处理步骤为：将石油降解菌接入种子培养基，接种量为5%，在温度为25～30℃，转速为160～200r/min下培养12～20h。步骤（2）所述的在种子液中加入固体培养基，培养处理步骤为：按质量比1∶1在种子液中加入固体培养基，搅拌均匀，在温度为25～30℃下培养2～3天。步骤（3）所述的将混合物和菌液混合，进行抽真空处理步骤为：按质量比1∶20将混合物和菌液混合，置于密闭装置中，连续抽真空2～4h，保持真空环境静置1～2天。步骤（3）所述的将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理步骤为：按质量比1∶10将聚乳酸纤维和离子液体混合均匀，在温度为70～75℃下搅拌2～3h。步骤（3）所述的在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理步骤为：按质量比5∶1在混合溶液中加入滤渣，在搅拌速度为500～600r/min下搅拌均匀，并在进风温度为110～120℃，出口温度为49～53℃下喷雾干燥5～10min。本发明与其他方法相比，有益技术效果是：（1）本发明将柚子皮和活性炭进行热解处理，作为菌液的载体，柚子皮里面的白色絮状层中含有大量的纤维素、半纤维，柚子皮还具有孔隙多，孔径大的特点，柚子皮具有紧凑的组织结构，内壁不光滑、多褶皱，孔隙较多，孔径较大，网络结构不明显，对油品具有一定的吸附，热解之后的柚子皮三维网状结构更为明显，大小孔交错相通，有利于快速吸油，孔径较热解之前增大明显，有利于吸油量的提高；人工载体因具备可控的比表面积、孔径分布以及传质性能好等优点，能与特定的微生物及复杂污染物更好地匹配，从而获得更优的固定化效果和修复性能；生物炭对石油有较强的吸附能力，以生物炭为载体制备石油降解菌剂投加入土壤后，会促进污染物由土壤向固定化载体迁移，使固定化载体同时富集微生物和污染物，增加微生物和污染物的接触，实现污染物的富集-降解一体化，有助于促进土壤修复效果；（2）本发明用液态和固态相结合的方式对包含2种细菌的石油降解菌剂进行培养，牛肉膏、蛋白胨作为液态培养基培养初级种子，然后接种到蔗糖和草炭的固态培养基中培养，制备出一种高效石油降解菌剂；草炭中富含有机质和腐殖酸，保水通气，是优良的土壤改良产品，假单胞菌能分泌表面活性剂鼠李糖脂，使石油均匀分散到水相中，枯草芽孢杆菌具有高效的石油降解性能，两株菌复合使用，能显著增加石油与菌株的接触面，提高石油降解率；（3）本发明采用物理吸附法和包埋法制备出一种保存时间长的石油降解菌剂，以热解后的柚子皮和活性炭为载体，将混合菌种吸附于基体表面或内孔表面，利用聚乳酸纤维将菌液限定在凝胶的微小格子中，同时能让基质渗入和产物扩散出来，使得石油降解菌剂的保存时间延长；（4）本发明采用喷雾干燥法制备石油降解菌剂，通过雾化器将物料溶液分散成雾状液滴，在干燥介质（热风）的作用下进行热交换，使雾状液滴中溶剂迅速蒸发，获得粉状制品的干燥过程。在干燥过程中液滴温度比较低，因而特别适合于热敏性物料（生物制品）的干燥，而且成品质量好。具体实施方式将新鲜柚子皮破碎，并置于温度为90～100℃的烘箱中干燥至恒重，即得破碎柚子皮，按质量比1∶1将破碎柚子皮和活性炭混合，在温度为300～400℃的马弗炉中热解3～4h，冷却至室温，研磨并过30～50目筛，即得混合物；按质量比1∶1将枯草芽孢杆菌和假单胞菌混合，即得石油降解菌；种子培养基为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节ph值为7.0，在温度为121℃下灭菌20min；固体培养基为：蔗糖10g，草炭10g，牛肉膏6g，酵母粉1.5g，蒸馏水1000ml，在温度为121℃下灭菌20min；将石油降解菌接入种子培养基，接种量为5%，在温度为25～30℃，转速为160～200r/min下培养12～20h，即得种子液，按质量比1∶1在种子液中加入固体培养基，搅拌均匀，在温度为25～30℃下培养2～3天，即得菌液；按质量比1∶20将混合物和菌液混合，置于密闭装置中，连续抽真空2～4h，保持真空环境静置1～2天后，过滤即得滤渣；按质量比1∶10将聚乳酸纤维和离子液体混合均匀，在温度为70～75℃下搅拌2～3h，冷却至室温，即得混合溶液，按质量比5∶1在混合溶液中加入滤渣，在搅拌速度为500～600r/min下搅拌均匀，并在进风温度为110～120℃，出口温度为49～53℃下喷雾干燥5～10min。冷却至室温，即得石油降解菌剂。实例1将新鲜柚子皮破碎，并置于温度为90℃的烘箱中干燥至恒重，即得破碎柚子皮，将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理，冷却至室温，研磨并过30目筛，即得混合物；将石油降解菌接入种子培养基，培养处理，即得种子液，在种子液中加入固体培养基，培养处理，即得菌液；将混合物和菌液混合，进行抽真空处理，过滤即得滤渣；将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理，冷却至室温，即得混合溶液，在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理，冷却至室温，即得石油降解菌剂。将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理步骤为：按质量比1∶1将破碎柚子皮和活性炭混合，在温度为300℃的马弗炉中热解3h。石油降解菌的制备步骤为：按质量比1∶1将枯草芽孢杆菌和假单胞菌混合，即得石油降解菌。种子培养基的组分和制备步骤为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节ph值为7.0，在温度为121℃下灭菌20min。固体培养基的组分和制备步骤为：蔗糖10g，草炭10g，牛肉膏6g，酵母粉1.5g，蒸馏水1000ml，在温度为121℃下灭菌20min。将石油降解菌接入种子培养基，培养处理步骤为：将石油降解菌接入种子培养基，接种量为5%，在温度为25℃，转速为160r/min下培养12h。在种子液中加入固体培养基，培养处理步骤为：按质量比1∶1在种子液中加入固体培养基，搅拌均匀，在温度为25℃下培养2天。将混合物和菌液混合，进行抽真空处理步骤为：按质量比1∶20将混合物和菌液混合，置于密闭装置中，连续抽真空2h，保持真空环境静置1天。将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理步骤为：按质量比1∶10将聚乳酸纤维和离子液体混合均匀，在温度为70℃下搅拌2h。在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理步骤为：按质量比5∶1在混合溶液中加入滤渣，在搅拌速度为500r/min下搅拌均匀，并在进风温度为110℃，出口温度为49℃下喷雾干燥5min。实例2将新鲜柚子皮破碎，并置于温度为93℃的烘箱中干燥至恒重，即得破碎柚子皮，将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理，冷却至室温，研磨并过39目筛，即得混合物；将石油降解菌接入种子培养基，培养处理，即得种子液，在种子液中加入固体培养基，培养处理，即得菌液；将混合物和菌液混合，进行抽真空处理，过滤即得滤渣；将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理，冷却至室温，即得混合溶液，在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理，冷却至室温，即得石油降解菌剂。将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理步骤为：按质量比1∶1将破碎柚子皮和活性炭混合，在温度为330℃的马弗炉中热解3h。石油降解菌的制备步骤为：按质量比1∶1将枯草芽孢杆菌和假单胞菌混合，即得石油降解菌。种子培养基的组分和制备步骤为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节ph值为7.0，在温度为121℃下灭菌20min。固体培养基的组分和制备步骤为：蔗糖10g，草炭10g，牛肉膏6g，酵母粉1.5g，蒸馏水1000ml，在温度为121℃下灭菌20min。将石油降解菌接入种子培养基，培养处理步骤为：将石油降解菌接入种子培养基，接种量为5%，在温度为26℃，转速为170r/min下培养14h。在种子液中加入固体培养基，培养处理步骤为：按质量比1∶1在种子液中加入固体培养基，搅拌均匀，在温度为26℃下培养2天。将混合物和菌液混合，进行抽真空处理步骤为：按质量比1∶20将混合物和菌液混合，置于密闭装置中，连续抽真空3h，保持真空环境静置1天。将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理步骤为：按质量比1∶10将聚乳酸纤维和离子液体混合均匀，在温度为72℃下搅拌2h。在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理步骤为：按质量比5∶1在混合溶液中加入滤渣，在搅拌速度为530r/min下搅拌均匀，并在进风温度为113℃，出口温度为50℃下喷雾干燥6min。实例3将新鲜柚子皮破碎，并置于温度为96℃的烘箱中干燥至恒重，即得破碎柚子皮，将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理，冷却至室温，研磨并过45目筛，即得混合物；将石油降解菌接入种子培养基，培养处理，即得种子液，在种子液中加入固体培养基，培养处理，即得菌液；将混合物和菌液混合，进行抽真空处理，过滤即得滤渣；将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理，冷却至室温，即得混合溶液，在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理，冷却至室温，即得石油降解菌剂。将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理步骤为：按质量比1∶1将破碎柚子皮和活性炭混合，在温度为360℃的马弗炉中热解3h。石油降解菌的制备步骤为：按质量比1∶1将枯草芽孢杆菌和假单胞菌混合，即得石油降解菌。种子培养基的组分和制备步骤为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节ph值为7.0，在温度为121℃下灭菌20min。固体培养基的组分和制备步骤为：蔗糖10g，草炭10g，牛肉膏6g，酵母粉1.5g，蒸馏水1000ml，在温度为121℃下灭菌20min。将石油降解菌接入种子培养基，培养处理步骤为：将石油降解菌接入种子培养基，接种量为5%，在温度为29℃，转速为180r/min下培养18h。在种子液中加入固体培养基，培养处理步骤为：按质量比1∶1在种子液中加入固体培养基，搅拌均匀，在温度为29℃下培养3天。将混合物和菌液混合，进行抽真空处理步骤为：按质量比1∶20将混合物和菌液混合，置于密闭装置中，连续抽真空4h，保持真空环境静置2天。将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理步骤为：按质量比1∶10将聚乳酸纤维和离子液体混合均匀，在温度为74℃下搅拌3h。在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理步骤为：按质量比5∶1在混合溶液中加入滤渣，在搅拌速度为560r/min下搅拌均匀，并在进风温度为116℃，出口温度为52℃下喷雾干燥8min。实例4将新鲜柚子皮破碎，并置于温度为100℃的烘箱中干燥至恒重，即得破碎柚子皮，将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理，冷却至室温，研磨并过50目筛，即得混合物；将石油降解菌接入种子培养基，培养处理，即得种子液，在种子液中加入固体培养基，培养处理，即得菌液；将混合物和菌液混合，进行抽真空处理，过滤即得滤渣；将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理，冷却至室温，即得混合溶液，在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理，冷却至室温，即得石油降解菌剂。将破碎柚子皮和活性炭混合，进行热解处理步骤为：按质量比1∶1将破碎柚子皮和活性炭混合，在温度为400℃的马弗炉中热解4h。石油降解菌的制备步骤为：按质量比1∶1将枯草芽孢杆菌和假单胞菌混合，即得石油降解菌。种子培养基的组分和制备步骤为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节ph值为7.0，在温度为121℃下灭菌20min。固体培养基的组分和制备步骤为：蔗糖10g，草炭10g，牛肉膏6g，酵母粉1.5g，蒸馏水1000ml，在温度为121℃下灭菌20min。将石油降解菌接入种子培养基，培养处理步骤为：将石油降解菌接入种子培养基，接种量为5%，在温度为30℃，转速为200r/min下培养20h。在种子液中加入固体培养基，培养处理步骤为：按质量比1∶1在种子液中加入固体培养基，搅拌均匀，在温度为30℃下培养3天。将混合物和菌液混合，进行抽真空处理步骤为：按质量比1∶20将混合物和菌液混合，置于密闭装置中，连续抽真空4h，保持真空环境静置2天。将聚乳酸纤维和离子液体混合，进行搅拌处理步骤为：按质量比1∶10将聚乳酸纤维和离子液体混合均匀，在温度为75℃下搅拌3h。在混合溶液中加入滤渣，搅拌并喷雾干燥处理步骤为：按质量比5∶1在混合溶液中加入滤渣，在搅拌速度为600r/min下搅拌均匀，并在进风温度为120℃，出口温度为53℃下喷雾干燥10min。对照例：大连某公司生产的石油降解菌剂。将实例及对照例制备得到的石油降解菌剂进行检测，具体检测如下：石油去除率：按0.5g的菌剂接种量，加入原油培养基中在160rpm，30℃摇床中培养，测定周降解率。设2平行，测定石油去除率。具体测试结果如表1。表1性能表征对比表检测项目实例1实例2实例3实例4对照例去除率/%50.749.849.550.316.8由表1可知，本发明制备的石油降解菌剂具有良好的除油效果。当前第1页12