一种与肾病综合征相关的肠道菌属Catabacter及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种与肾病综合征相关的肠道菌属，所述菌属为catabacter。

背景技术：

肾病综合征(nephroticsyndrome，ns)为一组以严重蛋白尿、低蛋白血症、高血脂及水肿为其主要表现的临床综合征，为临床多发难治性疾病，且为儿童多发疾病，严重威胁人类健康。目前ns治疗主要采用免疫抑制剂治疗，取得了一定疗效，但是ns预后与肾脏病理改变类型密切相关，疗效不一，而且许多患者对以上药物产生耐受，或因不良反应严重被迫停药，最终发展到晚期肾衰，给病人带来了沉重的经济负担。因此，深入探讨ns发病机制，寻找安全有效的治疗药物迫在眉睫。

膜性肾病(membranousnephropathy，mn)是一病理学诊断名词，其病理特征为弥漫性肾小球基底膜(glomerularbasementmembrane，gbm)增厚伴上皮细胞下免疫复合物沉积。mn是最常见的引起成人肾病综合征(nephroticsyndrome，ns)的病理类型之一。近几年国内外文献均有报道显示膜性肾病的发病率有明显上升趋势，并且越来越趋向年轻化，成为继iga肾病后又一高发的肾小球肾炎。

肾病综合征的诊断一般包括三个方面，首先是通过检测尿蛋白量以及血浆蛋白量进行确诊，然后进行肾活检，做出病理诊断，确认病因，最后判断有无并发症，但是肾活检往往给病人带来较大的痛苦和创伤。

随着生物技术的发展，高通量测序技术的广泛应用，人们发现肠道菌群的变化可以指示疾病的发生和疾病类型，目前肠道菌群在肾病综合征发展过程中的作用并不明确，探究肠道菌群与肾病综合征之间的相关性，为发展无创性的肾病综合征的诊断提供了新的手段。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肾病综合征相关的肠道菌属，通过检测该肠道菌属的丰度水平，可以诊断肾病综合征，从而实现患者的个性化治疗。

本发明经过广泛而深入的研究，通过收集肾病综合征的粪便样本，综合分析16srrna测序，发现与肾病综合征相关的肠道菌群，为肾病综合征的诊断寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了catabacter(凯特百可特菌属)在肾病综合征样本中的丰度显著降低，说明catabacter(凯特百可特菌属)可作为肾病综合征的预测因子。

本发明提供了检测catabacter(凯特百可特菌属)的试剂在制备诊断肾病综合征的产品中的应用。

进一步，所述产品通过测定样本中catabacter(凯特百可特菌属)的丰度来确定受试者是否患有肾病综合征，其中所述样本包括但不限于粪便样本、肠道排出物、肠道提取物。

进一步，所述样本为粪便样本。

进一步，所述试剂选自：

特异性扩增catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的引物，或

特异性识别catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的探针，或

特异性结合catabacter(凯特百可特菌属)蛋白序列的抗体或配体。

进一步，所述特异性扩增catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的引物针对catabacter(凯特百可特菌属)16srrna的可变区。

进一步，所述肾病综合征的病理类型为膜性肾小球肾炎。

本发明提供了一种诊断肾病综合征的产品，所述产品包括检测catabacter(凯特百可特菌属)的丰度的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

进一步，所述试剂选自：

特异性扩增catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的引物，或

特异性识别catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的探针，或

特异性结合catabacter(凯特百可特菌属)蛋白序列的抗体或配体。

进一步，所述特异性扩增catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的引物针对catabacter(凯特百可特菌属)16srrna的可变区，优选的，特异性扩增catabacter(凯特百可特菌属)核酸序列的引物针对catabacter(凯特百可特菌属)16srrna的v3-v4可变区。

作为一种优选的实施方式，本发明提供了一种基于检测catabacter(凯特百可特菌属)丰度的诊断肾病综合征的试剂盒。所述试剂盒组分如下：dna提取试剂、特异性检测catabacter(凯特百可特菌属)16srrna的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶逆转录酶、dnase、rnase抑制剂、depc-水、无菌水、sybrgreen荧光染料。

本发明提供了catabacter(凯特百可特菌属)在构建判断免疫综合征的计算模型中的应用。

本发明提供了一种利用微生物标志物预测肾病综合征的系统，包括：

核酸样本分离单元，用于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本；

测序单元，用于对分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；

数据处理单元，用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；

结果判定单元，用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。

进一步，所述微生物标志物包括catabacter(凯特百可特菌属)。

生物标志物

术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为dna，也可以为rna，可以是经修饰的dna或者rna，也可以为未经修饰的dna或者rna。在本文中基因标志物有时也可以称为特征片段。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。

根据本发明的实施例，分析肾病综合征的粪便样本，基于16srrna测序数据，对肾病综合征呈现差异的肠道菌群进行统计，从而确定与肾病综合征相关的特异性序列。

作为一种优选的实施方案，包括以下步骤：

(1)样品的收集与处理：收集相关粪便样本，使用试剂盒进行dna提取，得到核酸样本；

(2)文库构建和测序：利用高通量测序进行dna文库构建和测序，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；

(3)通过生物信息学的分析方法确定肾病综合征相关的特异性肠道微生物核酸序列。

首先，获得所述个体的粪便样本中的核酸序列的测序数据，所述测序数据包括多个读段；组装所述读段，获得基因集，所述基因集包括多个组装片段，所述基因集中的组装片段为非冗余序列；确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段；依据所述测序数据，分别确定所述基因集中的各个组装片段的丰度，其中包括，分别确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段的丰度；分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定各种微生物的丰度。

在本发明中，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如pgm，合成测序的技术平台比如illumina公司的hiseq、miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如pacbio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段。

在本发明中，所称的组装可以利用已知序列组装方法或软件进行，例如利用soapdenovo、velvet等。

根据本发明的一个实施例，通过将基因集中的组装片段与微生物参考序列运用软件metagenemark比对，依据与某种微生物参考序列的相似程度来判断组装片段是否来自该种微生物。所称参考序列指预先确定的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，若目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择ncbi数据库中的各种微生物的参考基因组和或metahit项目公开的dacc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，确定肾病综合征标志物中的各种微生物包含的组装片段包括：将所述基因集中的组装片段分别与所述各种微生物的参考序列进行比对，确定与一种微生物的参考序列的相似性大于或者等于90％的组装片段来自该种微生物。

根据本发明的一个实施例，所称的分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定所述肾病综合征标志物中的各种微生物的丰度的步骤中，微生物的丰度为该种微生物包含的所有组装片段的丰度的中位数或者平均数。

芯片、试剂盒、核酸膜条

本发明的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于catabacter(凯特百可特菌属)的核酸序列。

具体地，可根据本发明所述肠道菌属catabacter(凯特百可特菌属)，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

本发明的试剂盒包括检测catabacter(凯特百可特菌属)菌属丰度的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

作一种优选的实施方式，本发明的试剂盒包括反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶逆转录酶等酶、dnase、rnase抑制剂、depc-水、无菌水等。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肾病综合征的发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明的核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

在本发明中，正如熟练技术人员会领会的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合微生物标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于肾病综合征的风险或与有助于评估肾病综合征的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常个体、有肾病综合征风险的个体、具有肾病综合征的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估肾病综合征中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

在本发明中，术语“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为粪便。

在本发明中，“受试者”包括能够遭受或罹患肾病综合征的动物，受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，在某些实施方案中，所述受试者是大鼠。

catabacter：凯特百可特菌属。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了catabacter(凯特百可特菌属)与肾病综合征相关，catabacter(凯特百可特菌属)的丰度在病理类型为膜性肾小球肾炎的肾病综合征受试者中显著下调。通过检测受试者样本中catabacter(凯特百可特菌属)的丰度，可以判断受试者是否患有肾病综合征。

本发明发现一种新的微生物标志物，相比传统的肾活检的诊断手段，使用微生物诊断及时、特异、且无创，提高受试者的生活质量。

附图说明

图1是catabacter在综合征样本中的丰度图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1筛选与肾病综合征相关的肠道菌群

1、样本的采集

1.1膜性肾小球肾炎模型的构建

以sprague-dawley大鼠为实验动物，参照border方法(borderwa,wardhj,kamiles,etal.inductionofmembranousnephropathyinrabbitsbyadministrationofanexogenouscationicantigen.jclininvest,1982,69：451～461)，使用c-bsa对大鼠进行免疫，复制出典型而稳定的膜性肾小球肾炎模型。

1.1.1抗原阳离子化bsa(c-bsa)制备

天然牛血清白蛋白第v组分：电泳纯，等电点为4.5，ameresco公司。碳化二亚胺(edc)：北京化学试剂公司。无水乙二胺(eda)：分析纯，北京化学试剂公司。

用67mleda加500ml双蒸水，然后缓缓加入6m盐酸350ml，调ph至4.75，冰上冷却溶液至25℃，将5gbsa溶于25ml双蒸水，再将此溶液缓慢加入eda溶液，不断搅拌，加入1.8gedc，恒温25℃反应2h后用ph4.75的醋酸缓冲液30ml终止反应，即得等电点提高的c-bsa溶液。4℃双蒸水透析48h(每8小时换水)c-bsa溶液，冷冻干燥，得等电点(pi)为8.4以上的c-bsa粉剂，保存于-70℃备用。

1.1.2膜性肾小球肾炎模型的构建

实验动物为健康雌性sprague-dawley大鼠，体重160～180g，北京维通利华公司提供。适应性喂养3天后，随机分为2组：病理组10只，用c-bsa复制肾炎模型；正常对照组10只，正常饲养，不作任何处理。

用c-bsa1.5mg溶于0.5ml生理盐水，与0.5ml弗氏不完全佐剂混匀，制作“油包水”，作皮下多点注射预免疫，1周后每日注射c-bsa。先腹腔注射1周，第1日至第7日的剂量依次为0.5mg、0.5mg、1mg、1mg、2mg、2mg、2.5mg，之后改为尾静脉注射，共6周。尾静脉注射第1周第1天至第7天的剂量依次为2.5mg、2.5mg、3mg、3mg、4mg、4mg、5mg，此后每天5mg，直至试验结束。

1.2样本的采集

采集10只正常对照和10只肾病综合征大鼠的粪便样本，放到-80℃冰箱低温保存，记录样本的信息，本研究经伦理委员会审核与批准。

2、16srrna测序

样本16srrna的测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，具体步骤如下：

2.1dna的提取

使用omegabio-tek公司的粪便基因组dna提取试剂盒omega-soildnakit自粪便标本中提取细菌dna，操作步骤按说明书进行。

2.2dna样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna。

2.3pcr扩增及产物纯化

采用transgenap221-02(transstartfastpfudnapolymerase)进行pcr扩增反应，全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，同一样本的pcr产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶回收pcr产物，tris-hcl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。其中引物设计和pcr反应条件如下：

2.3.1引物设计

根据指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，引物序列如下：

338f：5’-actcctacgggaggcagcag-3’(seqidno.1)；

806r:5’-ggactachvgggtwtctaat-3’(seqidno.2)

2.3.2pcr扩增

1)配制20μl反应体系，具体如表1所示。

表1pcr反应体系

2)扩增

使用abi9700型pcr仪进行pcr扩增，扩增程序为：

95°3min，(95℃30s，55℃30s，72℃45s)×27个循环，72℃10min。

2.4荧光定量

将pcr产物用quantifluor^tm-st蓝色荧光定量系统(promega公司)进行检测定量。

2.5miseq文库构建

使用illumina公司的truseqtmdnasampleprepkit进行文库的构建，具体步骤按照说明书进行。

2.6miseq测序

以dna片段为模板，pcr合成目标待测dna片段，cbot上进行桥式pcr扩增，生成dna簇，hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。

3、数据分析

3.1数据预处理

使用flash、trimmomatic等软件对miseq测序得到的pereads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用usearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多out，采用rdpclassifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的otu进行生物信息统计分析，并使用silva数据库进行比对。

3.2肠道菌群物种差异分析

使用lefse多级物种差异判别分析进行差异物种的筛选，使用non-parametricfactorialkruskal-wallis(kw)sum-ranktest(非参数因子克鲁斯卡尔—沃利斯秩和检验)检测具有显著丰度差异特征，找到与丰度有显著性差异的类群；采用线性判别分析(lda)来估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小。筛选标准：lda值>2且p值<0.05。

4、结果

结果如图1所示，与正常对照相比，肾病综合征样本中的catabacter丰度水平显著降低(p<0.05)，且lda的值约为2.2，提示catabacter可作为微生物标志物应用于肾病综合征的诊断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>中国医学科学院药物研究所

<120>一种与肾病综合征相关的肠道菌属catabacter及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

actcctacgggaggcagcag20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggactachvgggtwtctaat20