一种促进草莓提早开花的RNA干扰载体FveDDM1-RNAi的应用的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，涉及一种草莓花期的调控方法，具体涉及一种促进草莓提早开花的rna干扰载体fveddm1-rnai的应用。
背景技术：
：草莓是多年生的蔷薇植物，在世界上有着很高的经济价值。因此，理解草莓的发育调控机制能够促进草莓育种和生产的发展。森林草莓(fragariavescal.，2n＝2x＝14)也称野草莓，是蔷薇科草莓属多年生草本植物，属二倍体，植株矮小，呈半平卧丛状生长。二倍体森林草莓(fragariavesca)与栽培草莓亲缘关系最相近，具有基因组小(240mbp)、再生周期短(约4个月)、植株较小等优势，是适用于遗传转化的理想模式植物。开花是植物重要的生命转变过程，是由营养生长到生殖生长的重大转变。从花诱导开始的一系列阶段，草莓从营养生长到生殖生长的过渡。开花受环境条件和发育调节控制，这种调节的复杂性是由复杂的信号传导途径网络造成的。调节植物的开花时间可以调控植物的生长发育，进而影响到产量。如果能借助技术将植物调节到最适合的开花时期，可以提高植物的产量。dna甲基化(dnamethylation)是目前表观遗传学研究的热点之一。dna甲基化是指以dna为受体,在dna甲基转移酶的作用下,将供体s-腺苷甲硫氨酸上的1个甲基转移至胞嘧啶的第5位碳原子上，从而形成5-甲基胞嘧啶(m5c)的过程。dna甲基化水平并不是稳定不变的，它是由dna甲基化和dna去甲基化共同调节的。dna的胞嘧啶甲基化发生在植物的cg，chg和chh(h＝a，c或t)序列中，是重复序列的表观遗传抑制的标志。染色质重塑因子drereaseindnamethylation1(ddm1)是swi2/snf2蛋白家族的成员，对dna甲基化至关重要，特别是在cg和chg序列中。dna甲基化是重要的表观遗传标记，甲基化水平过低或过高，都会影响植物生长发育和分化，导致发育和形态异常。目前对草莓花期的调控主要集中在改善栽培措施、激素处理和低温及短日照处理等方面，关于ddm1调控植物开花的报道鲜有发现。技术实现要素：本发明通过构建dna去甲基化的基因沉默载体，并用农杆菌转化法，获得了fveddm1的rnai转基因材料。证明了开花时间早于野生型，验证了fveddm1基因与草莓开花相关。本发明技术方案如下：本发明的第一个目的是提供森林草莓fveddm1基因在提早草莓的开花时间中的应用，所述森林草莓fveddm1基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。进一步的，抑制所述森林草莓fveddm1基因的表达，能够提早草莓的开花时间。进一步的，将针对森林草莓fveddm1基因的rnai载体导入森林草莓，抑制所述森林草莓fveddm1基因的表达，能够提早草莓的开花时间。本发明的第二个目的是提供一种森林草莓fveddm1基因的rnai载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：s1：以森林草莓cdna序列为模板，设计特异性引物fveddm1-rnai-f1:5’-actctgcaggtcgacttggcccgaacttcc-3’(seqidno.4)，fveddm1-rnai-r1:5’-aataatatggtcgacgagaagaaagggacg-3’(seqidno.5)，扩增得到森林草莓fveddm1基因rna干扰片段的正向序列(seqidno.8)，长度为392bp：ttggcccgaacttcccaataattgttacttcatatgaagtggcgttggctgatgcaagaagatgtttaagacactacaactggaaatatctcgtggttgatgaaggacacagattgaaaaactccaagtgcaaactagtgcagcagttgaagtacatacctgtagagaataagattctgttgactggaacacctctccagaataatttggctgagctttggtcgttgttgaactttattttgccggatatattctcatcccatgaagaatttgagtcgtggtttgacctagaaggaaagtgccataatgaagcaatgaaggaagaattagaagagaagagaagagctcaagtgctaccgaaactccatgcaatattgcgtccctttcttctc；设计特异性引物fveddm1-rnai-f2:5’-ttgcaaagctctagagagaagaaagggacg-3’(seqidno.6)，fveddm1-rnai-r2:5’-tgaacgatctctagattggcccgaacttcc-3’(seqidno.7)，扩增得到森林草莓fveddm1基因rna干扰片段的反向序列(seqidno.9)，长度为392bp：gagaagaaagggacgcaatattgcatggagtttcggtagcacttgagctcttctcttctcttctaattcttccttcattgcttcattatggcactttccttctaggtcaaaccacgactcaaattcttcatgggatgagaatatatccggcaaaataaagttcaacaacgaccaaagctcagccaaattattctggagaggtgttccagtcaacagaatcttattctctacaggtatgtacttcaactgctgcactagtttgcacttggagtttttcaatctgtgtccttcatcaaccacgagatatttccagttgtagtgtcttaaacatcttcttgcatcagccaacgccacttcatatgaagtaacaattattgggaagttcgggccaa。s2：通过sali酶切位点将森林草莓fveddm1基因rna干扰片段的正向序列连接到gn2300通用载体；通过xbai酶切位点森林草莓fveddm1基因rna干扰片段的反向序列连接到gn2300通用载体；s3：将得到的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证，得到含有森林草莓fveddm1基因rna干扰片段正向序列-森林草莓fveddm1基因rna干扰片段反向序列的森林草莓fveddm1基因的rnai载体gn2300-fveddm1。本发明的第三个目的是提供前述方法构建得到的森林草莓fveddm1基因的rnai载体。本发明的第四个目的是提供前述的森林草莓fveddm1基因的rnai载体在提早草莓的开花时间中的应用。本发明的第五个目的是提供转染了前述森林草莓fveddm1基因的rnai载体的转基因工程菌。本发明的第六个目的是提供前述的转染了森林草莓fveddm1基因的rnai载体的转基因工程菌在提早草莓的开花时间中的应用。本发明有益效果在于(1)本发明通过下调fveddm1基因表达可获得开花时间提早的草莓植株，这为调控草莓开花时间提供了一种新思路。(2)本发明通过转基因方式提早草莓的开花时间，克服了目前常用的调控开花时间方法中效率低的缺点。通过遗传转化的方式，为草莓的花期调控提供了一种更高效的方法。(3)本发明将fveddm1-rnai载体转入草莓中，成功获得了开花时间较早的植株，实现了利用rna干扰技术获得开花早的目标，为rna干扰的植物分子育种提供了参考。附图说明图1为转入森林草莓fveddm1基因的gn2300-fveddm1-rnai载体后的1-②2/3株系第五棵ruegen(右)与野生型ruegen的开花(左)对比；图2为转入森林草莓fveddm1基因的gn2300-fveddm1-rnai载体后的1-②2/3株系第六棵ruegen(右)与野生型ruegen的开花(左)对比；图3为转入森林草莓fveddm1基因的gn2300-fveddm1-rnai载体后的1-②2/3株系第七棵ruegen(右)与野生型ruegen的开花(左)对比；图4为转入森林草莓fveddm1基因的gn2300-fveddm1-rnai载体后的1-②2/3株系第一棵ruegen(右)与野生型ruegen的开花(左)对比。具体实施方式实施例1fveddm1基因的克隆根据tair(https://www.arabidopsis.org/)公布的拟南芥ddm1基因全长cds(序列如seqidno.1所示)，在gdr网页(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/fragaria_vesca/fvesca-genome.v2.0.a2/genes/)下载草莓基因库，用bioedit软件本地比对出森林草莓对应的fveddm1的cds，同理，比对出蛋白序列(cds长2178bp，序列如seqidno.2所示，fveddm1基因编码的氨基酸序列如seqidno.3所示)提取野生型森林草莓总rna，反转录为cdna，所述森林草莓的cds获取于gdr网站(下载网址为ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/fragaria_vesca/fvesca-genome.v2.0.a2/genes/)以野生型森林草莓的cdna为模板，对fveddm1基因pcr扩增，插入正向片段。用snapgene软件设计引物seqidno.4与seqidno.5用来扩增基因正向目的片段，pcr反应体系如表1所示。表1：引物序列如下：fveddm1-rnai-f1:5’-actctgcaggtcgacttggcccgaacttcc-3’(seqidno.4)，fveddm1-rnai-r1:5’-aataatatggtcgacgagaagaaagggacg-3’(seqidno.5)将pcr程序设定为：94℃预变性2min，98℃变性10s、55℃退火30s、延伸温度为68℃，延伸时间根据扩增片段长度来计算(1kb/min)，延伸时间为25s，设置33个循环，最后68℃延伸10min。扩增得到如seqidno.8所示的森林草莓fveddm1基因rna干扰片段的正向序列，长度为392bp：以野生型森林草莓的cdna为模板，对fveddm1基因pcr扩增，插入反向片段。pcr反应体系与表1相同。用snapgene软件设计引物seqidno.6与seqidno.7用来扩增基因反向目的片段。引物序列如下：fveddm1-rnai-f2:5’-ttgcaaagctctagagagaagaaagggacg-3’(seqidno.6)，fveddm1-rnai-r2:5’-tgaacgatctctagattggcccgaacttcc-3’(seqidno.7)pcr程序与扩增基因正向目的片段时相同。扩增得到如seqidno.9所示的森林草莓fveddm1基因rna干扰片段的反向序列，长度为392bp：实施例2gn2300-fveddm1-rnai载体的构建1.正向片段的连接采用onestepcloningkit(vazyme)重组克隆试剂盒，在gn2300-35s-faq-nos载体上选择sali作为酶切位点，用限制性内切酶对克隆载体进行线性化处理,置于37℃水浴锅中，反应4小时。反应体系如表2所示：表2：酶切后失活65℃，20分钟，用于重组反应。于冰水浴中配制反应体系，如表3所示：表3：配制好上述混合好的反应液后将其放置在37℃水浴锅中水浴30min。将反应液在冰上冷却5min；2.反向片段的连接在已连接上正向片段的gn2300-35s-faq-nos载体上选择xbai作为酶切位点，连接反向片段，连接方法除将反应体系中正向片段扩增产物替换为反向片段扩增产物外，其他与正向片段连接反应相同。3.转化反应(1)从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞dh5α，大肠杆菌感受态在冻融时，加入10μl已正向、反向连接后得到的第2步骤中的反应液，冰上放置30min；(2)放入42℃恒温水浴锅中水浴90s；(3)冰水中放置2min；(4)在超净工作台上加入700μl的不含任何抗生素的lb液体培养基，在速度为200转/分钟的37℃摇床上大肠杆菌，时间为1h；(5)4,000转/分钟，离心1min；(6)在超净工作台中弃去上清液，留下约100μl，重悬菌块，用枪头将菌液吸出，打在含有50mg/l卡那霉素的lb固体培养基上，用灭菌后的冷却的涂抹棒均匀地涂抹开，用封口膜封上，写上名字。将其倒置在37℃过夜培养12-16小时；(7)待菌落形成后，挑取单菌落，放入含有kana的lb液体培养基中，进行菌落pcr验证。经过电泳检测后选择可能为阳性的克隆菌株，送去公司测序，比对其基因序列完全正确后，得到含有森林草莓fveddm1基因rna干扰片段正向序列-森林草莓fveddm1基因rna干扰片段反向序列的森林草莓fveddm1基因的gn2300-fveddm1-rnai载体。(8)提取大肠杆菌重组质粒，转化到gv3101农杆菌菌株中，用50％的甘油保存菌液，放-80°冰箱保存。实施例3转化草莓进行功能验证1.外植体的准备外植体选择森林草莓生态型ruegen的幼嫩叶片。用镊子剥下ruegen的果实的种子，放在滤纸上，待风干后，挑选约200粒饱满的种子，装在5毫升离心管中。在超净工作台上进行以下操作：在离心管中加入约2毫升75％酒精，震荡颠倒约5分钟后吸出全部酒精。向离心管中加入无菌水，清洗3-5次以去除多余的酒精。接着加入2毫升的10％次氯酸钠(次氯酸钠需要避光保存)，震荡8分钟后吸出次氯酸钠。向离心管中加入无菌水，清洗5-7次以去除次氯酸钠，避免残留。清洗完毕后将种子倒在无菌滤纸上，用无菌的冷却的镊子在每一个装有ms固体培养基的组培瓶中放置4-5颗种子，在瓶盖上做好标记，放于黑暗的28℃恒温培养箱，待发芽后，置于光下培养。外植体选用叶龄15-20天左右、长势一致、饱满的嫩叶。2.农杆菌侵染转化(1)菌种活化：在-80℃冰箱中取出含有森林草莓fveddm1基因的gn2300-fveddm1-rnai载体的gv3101根癌农杆菌菌株100μl，在lb固体培养基平板上划线，在28℃恒温箱中倒置培养1-2天，待长出单菌落后，将挑取的单菌落置于加了50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的lb液体培养基中，在28℃恒温摇床中以200rpm培养1-2天，待菌液颜色小摇至浅黄。吸取100-150μl小摇的菌液，加入50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的lb液体培养基中在28℃恒温摇床上以200rpm过夜大摇，200rpm。将摇好的菌液4500rpm室温离心5min,弃滤液，收集菌块并用灭菌的ms悬浮液(ms悬浮液中加入乙酰丁香酮(as)至100μm)重新悬浮，测定od600值，将od600调至约0.48，然后将菌液放置于28℃恒温摇床，100rpm，悬浮1h。(2)侵染叶片：在菌液悬浮的空隙时间，从组培瓶中剪下状态一致的叶龄在15-20天左右的嫩叶，用刀片将草莓叶片背面划伤，叶片全都切完后，将叶片放入ms菌液悬浮液，放28℃摇床，100rpm侵染20分钟。侵染完毕后将菌液倒尽，用无菌滤纸吸干叶片上残留的菌液，并将其转移至共培养培养基上，在黑暗环境中共培养3天。待弱光下脱菌15天后，将长出愈伤的外植体移动到筛选培养基上，移到光下进行培养，温度设置为22℃，每2周更换一次培养基。(3)当产生不定芽时，把不定芽切成若干小段，转移至生芽培养基中。待叶片长出后转到生根培养基中，当长成完整小苗时，缓苗后移入花盆。实验中所用到的培养基配方如下(如无特别标注，ph均调至5.8)：①1/2ms固体培养基：蔗糖20g/l、1/2ms培养基粉末4.302g/l、琼脂7g/l，②lb固体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉10g/l，ph7.0③lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠10g/l，ph7.0④ms固体培养基：ms培养基粉末(包含维生素)4.406g/l、蔗糖30g/l、琼脂粉7g/l⑤ms-b5固体培养基：ms培养基粉末(不含维生素)4.302g/l、蔗糖20g/l、b5有机溶液5ml/l、琼脂粉7g/l⑥草莓共培养培养基：ms-b5培养基+2mg/ltdz+0.2mg/liba+20mg/las⑦草莓脱菌培养基：ms-b5培养基+2mg/ltdz+0.2mg/liba+300mg/lti⑧草莓筛选培养基：ms-b5培养基+3mg/l6-ba+0.2mg/liba+300mg/lti+20mg/lkan⑨草莓生芽培养基：ms-b5培养基+2mg/l6-ba+0.2mg/liba+300mg/lti+20mg/lkan⑩草莓生根培养基：ms-b5培养基+0.2mg/liba+300mg/lti实验中所用的激素配制方法如下：①tdz(2mg/ml)：称取20mgtdz粉末，用200μl的1m氢氧化钠溶液溶解后，待完全溶解后加入纯酒精，定容到10ml，放-20℃保存备用。②iba(1mg/ml)：称取10mgiba粉末，用无菌蒸馏水定容至10ml，放-20℃保存备用。③as(20mg/ml)：称取20mgas粉末，用dmso定容至1ml，放-20℃保存备用。④ti(300mg/ml)：称取3gti，用蒸馏水定容至10ml，放-20℃保存备用。⑤kan(100mg/ml)：称取kan500mg，用蒸馏水定容至5ml，放-20℃保存备用。⑥ms-b5有机溶液：称取烟酸0.2g，肌醇20g，维生素b12g，维生素b60.2g，用蒸馏水溶解定容至1l，放4℃冰箱保存备用。⑦1m氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠片状物6.0g，用蒸馏水溶解，定容至150ml，室温保存。3.转基因植株的gus染色验证配制好gus染液，剪下转基因草莓植株的叶片，将叶片进行染色处理。若染色成功，则表明gus报告基因已在植株内成功表达，转入草莓基因组中。4.转基因植株进行观察分析表型移栽时间花朵数目统计时间野生型草莓2018年9月12日02018年11月22日转基因株系12018年9月12日42018年11月22日转基因株系22018年9月12日22018年11月22日转基因株系32018年9月12日12018年11月22日转基因株系42018年9月12日12018年11月22日由以上结果可以看出，与野生型草莓植株相比，转基因的草莓植株开花时间都比野生型植株要早。同等培养条件下，野生型草莓植株经历了71天还未开花，而转入fveddm1-rnai载体的转基因草莓移栽后71天已经开花。根据以上结果表明，将针对森林草莓fveddm1基因的rnai载体导入森林草莓，从而抑制所述森林草莓fveddm1基因的表达，能够提早草莓的开花时间。fveddm1-rnai载体能促进草莓提早开花，fveddm1-rnai载体是具有功能的载体，它能促进生殖生长，促使植株提前开花。序列表<110>南京农业大学<120>一种促进草莓提早开花的rna干扰载体fveddm1-rnai的应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2770<212>dna<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)<400>1aaaaaataagaaaataggcgtaaatatgagagtgtgttttttcaatataccctcggtttt60gaatttgctctcaaaagcgacggagacgactgtttggctcggtgatttctcccgccgttt120gggtttttcttaccggaatttccttctccttcgatggttagtctgcgctccagaaaagtt180attccggcttcggaaatggtcagcgacgggaaaacggagaaagatgcgtctggtgattca240cccacttctgttctcaacgaagaggaaaactgtgaggagaaaagtgttactgttgtagag300gaagagatacttctagccaaaaatggagattcttctcttatttctgaagccatggctcag360gaggaagagcagctgctcaaacttcgggaagatgaagagaaagctaacaatgctggatct420gctgttgctcctaatctgaatgaaactcagtttactaaacttgatgagctcttgacgcaa480actcagctctactctgagtttctccttgagaaaatggaggatatcacaattaatgggata540gaaagtgagagccaaaaagctgagcccgagaagactggtcgtggacgcaaaagaaaggct600gcttctcagtacaacaatactaaggctaagagagcggttgctgctatgatttcaagatct660aaagaagatggtgagaccatcaactcagatctgacagaggaagaaacagtcatcaaactg720cagaatgaactttgtcctcttctcactggtggacagttaaagtcttatcagcttaaaggt780gtcaaatggctaatatcattgtggcagaatggtttgaatggaatattagctgatcaaatg840ggacttggaaagacgattcaaacgatcggtttcttatcacatctgaaagggaatgggttg900gatggtccatatctagtcattgctccactgtctacactttcaaattggttcaatgagatt960gctaggttcacgccttccatcaatgcaatcatctaccatggggataaaaatcaaagggat1020gagctcaggaggaagcacatgcctaaaactgttggtcccaagttccctatagttattact1080tcttatgaggttgccatgaatgatgctaaaagaattctgcggcactatccatggaaatat1140gttgtgattgatgagggccacaggttgaaaaaccacaagtgtaaattgttgagggaacta1200aaacacttgaagatggataacaaacttctgctgacaggaacacctctgcaaaataatctt1260tctgagctttggtctttgttaaattttattctgcctgacatctttacatcacatgatgaa1320tttgaatcatggtttgatttttctgaaaagaacaaaaacgaagcaaccaaggaagaagaa1380gagaaaagaagagctcaagttgtttccaaacttcatggtatactacgaccattcatcctt1440cgaagaatgaaatgtgatgttgagctctcacttccacggaaaaaggagattataatgtat1500gctacaatgactgatcatcagaaaaagttccaggaacatctggtgaataacacgttggaa1560gcacatcttggagagaatgccatccgaggtcaaggctggaagggaaagcttaacaacctg1620gtcattcaacttcgaaagaactgcaaccatcctgaccttctccaggggcaaatagatggt1680tcatatctctaccctcctgttgaagagattgttggacagtgtggtaaattccgcttattg1740gagagattacttgttcggttatttgccaataatcacaaagtccttatcttctcccaatgg1800acgaaacttttggacattatggattactacttcagtgagaaggggtttgaggtttgcaga1860atcgatggcagtgtgaagctggatgaaaggagaagacagattaaagatttcagtgatgag1920aagagcagctgtagtatatttctcctgagtaccagagctggaggactcggaatcaatctt1980actgctgctgatacatgcatcctctatgacagcgactggaaccctcaaatggacttgcaa2040gccatggacagatgccacagaatcgggcagacgaaacctgttcatgtttataggctttcc2100acggctcagtcgatagagacccgggttctgaaacgagcgtacagtaagctcaagctggaa2160catgtggttattggccaagggcagtttcatcaagaacgtgccaagtcttcaacaccttta2220gaggaagaggacatactggcgttgcttaaggaagatgaaactgctgaagataagttgata2280caaaccgatataagcgatgcggatcttgacaggttacttgaccggagtgacctgacaatt2340actgcaccgggagagacacaagctgctgaagcttttccagtgaagggtccaggttgggaa2400gtggtcctgcctagttcgggaggaatgctgtcttccctgaacagttaggacacattaata2460agccaggccttgaaaccacttctgtgttttttttttttttttccggaacatgatcggtta2520cttttggctgggaggatttaattattagagggctcggaagtttttgtaagttaaagaact2580cacttaaaaccctgaaaacatgacagttaatggtgattagctctcaatgtgatgaaaaca2640attggccctctgattttgctgttgcggtaatattatgacttgtgtacgtttatagtcttt2700gtagtctgcaattttggcattgagctatttctcacgaacttatgggatcttatgttttgg2760atttgggatt2770<210>2<211>2178<212>dna<213>森林草莓(fragariavesca)<400>2atggcgacgaagaccgagccggcggcggattctcccacttcggttctcgaggaagaggat60ttgtgtggggagattgatgtgaaattggtgaaggcggaggaggagctgctcgaggttcgg120gttaaggaagaggagacagaaagggagaaggagacacccgtcttgagtgagactcagttc180agcaagttggatgagcttctcactaagactcagctttttacagactttttgctcgagaaa240atggatgacatctcttttgatgttcccgagcaactgaatgaacctgaacctgtgcagaaa300aagagaggccgcggtacgaaaagaaaggctcctacttacaataatactaaggccaagagg360gcagttgcggctatgcttacaagatctaaagagggtgagaaaattgaagatgtgaaccta420actgaggaggaaagacttgagaaacagcaaaaggaacttgtacctctactgactggtggc480aaattgaagtcttatcaactcaaaggtgtaaagtggttgatctctttatggcaaaatggg540ctcaatgggatccttgcagaccaaatgggacttggcaagactatccagaccataggtttt600ctttctcatctaaaatctatgggattggatgggccctacttggtgattgctcctctttct660actctttccaactggattaatgaaatctcaaggtttacgccttcaattaaggctataatc720tatcatggtaacaagaaagaaagggatgagataataaggaagcacatgcccaaatcagtt780ggcccgaacttcccaataattgttacttcatatgaagtggcgttggctgatgcaagaaga840tgtttaagacactacaactggaaatatctcgtggttgatgaaggacacagattgaaaaac900tccaagtgcaaactagtgcagcagttgaagtacatacctgtagagaataagattctgttg960actggaacacctctccagaataatttggctgagctttggtcgttgttgaactttattttg1020ccggatatattctcatcccatgaagaatttgagtcgtggtttgacctagaaggaaagtgc1080cataatgaagcaatgaaggaagaattagaagagaagagaagagctcaagtgctaccgaaa1140ctccatgcaatattgcgtccctttcttctccgaagaatgaagatagatgttgagctgatg1200cttccaagaaagaaggaaatcatactatatgcaaccatgacagagcatcaaaagaagttt1260caggaacatctgatcaataagacactggagaaacatctaatacttgaaaagggaagccat1320gtaaatggcctgaaagggaagctgaacaatttgatgatccaacttcggaagaactgcaat1380catcctgaccttctagagtcggcatttgatggatcatatttctacccgcctgttgaccag1440atagttgagcaatgtgggaaatttagcttgcttgaaagactgttgaagctgctgcttgcc1500ggcaaacataaggttctgatattctcgcagtggaccaagattttggatataatggattac1560tattttagcgaaaaaggatatgaagtttgtagaattgatggccatgtgaaactggatgat1620cggagaagacagattgcttcgttcaatgatttagacagcacttgtagaatattcctactg1680agcacaagagccggtggactaggtatcaaccttactgcagctgatacctgtatactgtat1740gacagtgattggaaccctcaaatggatttgcaagccatggatagatgtcacaggattggg1800caaaccaagcctgttcatgtttaccggttggcaacagcacaatctgtagagggtcggatg1860ttaaaaagagcttttagcaagttgaagcttgaacatgtagttattggaaaagggaagttc1920catcaggaaagagccaagcctgaggcagatttcttggaggaagaggatctcatagcactt1980ctccgagatgaagaatctgctgaagacaagatgatacagacagatatcactgatgaagag2040ctggagaaagtcttggatcgcagtgatctcattgggactcctcctgatgctgctgatgcg2100cttcccctgaagggacctggctgggaagtggtggttcctaccgctagtgggggcatgctc2160tcctcccttaatagttag2178<210>3<211>725<212>prt<213>森林草莓(fragariavesca)<400>3metalathrlysthrgluproalaalaaspserprothrservalleu151015gluglugluaspleucysglygluileaspvallysleuvallysala202530gluglugluleuleugluvalargvallysgluglugluthrgluarg354045glulysgluthrprovalleusergluthrglnpheserlysleuasp505560gluleuleuthrlysthrglnleuphethrasppheleuleuglulys65707580metaspaspileserpheaspvalprogluglnleuasngluproglu859095provalglnlyslysargglyargglythrlysarglysalaprothr100105110tyrasnasnthrlysalalysargalavalalaalametleuthrarg115120125serlysgluglyglulysilegluaspvalasnleuthrglugluglu130135140argleuglulysglnglnlysgluleuvalproleuleuthrglygly145150155160lysleulyssertyrglnleulysglyvallystrpleuileserleu165170175trpglnasnglyleuasnglyileleualaaspglnmetglyleugly180185190lysthrileglnthrileglypheleuserhisleulyssermetgly195200205leuaspglyprotyrleuvalilealaproleuserthrleuserasn210215220trpileasngluileserargphethrproserilelysalaileile225230235240tyrhisglyasnlyslysgluargaspgluileilearglyshismet245250255prolysservalglyproasnpheproileilevalthrsertyrglu260265270valalaleualaaspalaargargcysleuarghistyrasntrplys275280285tyrleuvalvalaspgluglyhisargleulysasnserlyscyslys290295300leuvalglnglnleulystyrileprovalgluasnlysileleuleu305310315320thrglythrproleuglnasnasnleualagluleutrpserleuleu325330335asnpheileleuproaspilepheserserhisglugluphegluser340345350trppheaspleugluglylyscyshisasnglualametlysgluglu355360365leugluglulysargargalaglnvalleuprolysleuhisalaile370375380leuargpropheleuleuargargmetlysileaspvalgluleumet385390395400leuproarglyslysgluileileleutyralathrmetthrgluhis405410415glnlyslyspheglngluhisleuileasnlysthrleuglulyshis420425430leuileleuglulysglyserhisvalasnglyleulysglylysleu435440445asnasnleumetileglnleuarglysasncysasnhisproaspleu450455460leugluseralapheaspglysertyrphetyrproprovalaspgln465470475480ilevalgluglncysglylyspheserleuleugluargle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