本发明涉及血液样本保存装置，尤其涉及一种血液游离dna保存管。
背景技术：
血浆游离dna是存在于人体血液中一种无细胞状态的胞外dna，目前主要应用于肿瘤筛查及产前诊断两大领域。在肿瘤筛查领域，通过分子检测技术手段观察到血浆游离dna与肿瘤细胞dna有相同的基因突变，且游离dna的水平在癌症患者中明显增高；产前诊断领域，游离dna的临床应用包含性别判定，单基因紊乱，非整倍体检测等。因此，血浆游离dna作为标记物应用于临床疾病的诊断、预后、监测等有重大意义。
血液中的cfdna水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，此外，在母体血液中也能找到胎儿的cfdna。血液中的cfdna检测已经被广泛用于各种癌症、某些自身免疫疾病如红斑狼疮的筛查，以及胎儿遗传疾病如唐氏综合征的无创检测。
目前血液游离dna的检测实践中存在样本的保存问题，游离dna容易被氧化和被血液中的核酸降解酶降解，而且血液中的血细胞破裂释放出的基因组dna也会污染游离dna，这给实际的检测工作带来了很大的局限性。
解决上述问题可以通过改进保存管，提高保存管的密封性和取样的方便性，减少外部因素对游离dna的影响；也可以通过改进保存管内的保存液防止游离dna被核酸降解酶破坏，减少血液中的血细胞破裂，从而减少基因组dna对游离dna的污染，提高检测的准确性。
技术实现要素：
针对背景技术中存在的问题，本发明提供一种密封效果好、保存时间长的血液dna保存管。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种血液游离dna保存管，包括管体和设置在管体开口端的管塞，管塞中心开有取样孔，取样孔的下方弹性盖片，弹性盖片的一端固定在管塞下方的取样孔上，另一端在弹力作用下可活动的盖在取样孔下方，管塞上还设有可管体相匹配的管帽，管帽的中心位置设有和取样孔相适应的橡胶凸起，管体内装有游离dna保存液。
其中所述的游离dna保存液由包括如下组分制备得到：甘氨酸10-50mg/ml、谷氨酰胺1-5mg/ml、葡萄糖1-5mg/ml、原钒酸钠200-1000mg/ml、氟化铝1-5mg/ml、乙酰半胱氨酸10-40mg/ml、重氮烷基脲100-500mg/ml、抗凝剂1-3mg/ml、膜保护剂5-20mg/ml。
所述的游离dna保存液优选由包括如下组分制备得到：甘氨酸20-40mg/ml、谷氨酰胺2-4mg/ml、葡萄糖2-4mg/ml、原钒酸钠400-800mg/ml、氟化铝2-4mg/ml、乙酰半胱氨酸15-35mg/ml、重氮烷基脲200-400mg/ml、抗凝剂1.5-2.5mg/ml、膜保护剂8-15mg/ml。
进一步的，所述的抗凝剂选择edta-3k和eddha盐中一种或多种，所述的膜保护剂选择山梨醇、鼠李糖、海藻糖中一种或多种。
进一步的，其中抗凝剂为edta-3k，膜保护剂为山梨醇和海藻糖。
进一步的，所述的山梨醇和海藻糖的质量比为1:2~2:1。
所述的血液游离dna保存管中的游离dna保存液由包括如下组分制备得到：甘氨酸30mg/ml、谷氨酰胺3mg/ml、葡萄糖3mg/ml、原钒酸钠600mg/ml、氟化铝3mg/ml、乙酰半胱氨酸25mg/ml、重氮烷基脲300mg/ml、edta-3k含量为2.0mg/ml，山梨醇含量为6mg/ml，山海藻糖含量为6mg/ml。
进一步的，其中抗凝剂为edta-3k和eddha–na，膜保护剂为鼠李糖。
进一步的，所述的edta-3k和eddha–na的质量比为1:1~4:1。
述的血液游离dna保存管中的游离dna保存液由包括如下组分制备得到：甘氨酸100mg/ml、谷氨酰胺4mg/ml、葡萄糖2mg/ml、原钒酸钠500mg/ml、氟化铝3mg/ml、乙酰半胱氨酸30mg/ml、重氮烷基脲250mg/ml、eedta-3k含量1.5mg/ml，eddha–na含量为0.8mg/ml，鼠李糖含量为10mg/ml。
本发明一种血液游离dna保存管，密封性好、使用方便，有效减缓血细胞的破裂，防止血细胞中的dna稀释和污染目标cfdna，阻止核酸酶降解目标cfdna，提高含有目标游离核酸的血液样本的保存期。
本发明血液游离dna保存管中的保存液选择新种类抗凝剂和膜保护剂为重点进行研究，基于eddha中多种价键提供的独特螯合性能以及与血液/试剂中其他成分良好的兼容性申请人以部分eddha–na替换常用抗凝剂edta-3k；基于鼠李糖、海藻糖对细胞低毒和高盐条件下良好的张力和表面活性剂性能，选用山梨醇、海藻糖、鼠李糖的膜保护剂。实验证明上述策略制成的新型游离核酸保存液能实现优异的保护效果。
使用本申请血液游离dna保存管保护性能优于市面上常用的国产肝素钠真空采血管以及价格高昂的进口真空采血管如streck无创检测采血管，在常温下可以为cfdna提供接近3周的保护时间，在4摄氏度低温下保存时间更长。
附图说明
图1本发明血液游离dna保存管的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步解释。
实施例1
本实施例提供一种血液游离dna保存管，包括管体1和设置在管体开口端的管塞2，管塞2中心开有取样孔3，取样孔3的下方弹性盖片4，弹性盖片4的一端固定在管塞2下方的取样孔3上，另一端在弹力作用下可活动的盖在取样孔下方，管塞2上还设有可管体1相匹配的管帽5，管帽5的中心位置设有和取样孔3相适应的橡胶凸起6，管体1内装有游离dna保存液7。本发明血液游离dna保存管密封性好，有利于提高游离dna的保存期限，而且取用方便。
实施例2：保存液的配置
对于血液游离dna保存管内的保存液，申请人以选择新种类抗凝剂和膜保护剂为重点研究进行研究。基于eddha中多种价键提供的独特螯合性能以及与血液/试剂中其他成分良好的兼容性申请人以部分eddha–na替换常用抗凝剂edta-3k；基于鼠李糖、海藻糖对细胞低毒和高盐条件下良好的张力和表面活性剂性能，选用山梨醇、海藻糖、鼠李糖的膜保护剂。
按照采用的抗凝剂不同，将配方分为三组，为简化因素起见，以下实验配方中均采用甘氨酸100mg/ml、谷氨酰胺4mg/ml、葡萄糖2mg/ml、原钒酸钠500mg/ml、氟化铝3mg/ml、乙酰半胱氨酸30mg/ml、重氮烷基脲250mg/ml。下表显示的也仅是最后总结验证时使用的有代表性的成分配比，前期部分方向不对或无代表性的配比种类也未显示。
配制中将所需量的各种试剂以无rnase酶活的纯净水溶解。
表1基于edta-3k抗凝剂的配方
表2基于eddha–na抗凝剂的配方
表3基于edta-3k和eddha–na抗凝剂的配方
将上述核酸保存剂按照每毫升采血量0.02ml灌装入实施例1中的血液游离dna保存管。
实施例3：各配方性能比较
供试品：实施例2所得配方1-14血液游离dna保存管；
对照品：康捷肝素锂采血管：江苏康捷生产；streck无创真空采血管：streck生产（抗凝剂，保护剂不明，推测为edta和糖类等）；空白玻璃采血管；
在研究阶段试剂多采用知名进口试剂，本领域技术人员可以理解，出于价格/获取便利性等原因这些试剂可以被近似/更高品质的国产/进口试剂替代，实现的效果相同或近似。
征集3名22-25岁的男性志愿者（经过体检：血常规指标正常，无体检肿瘤指症，无炎症指症），分别采血180ml（配方1-14采血管、康捷肝素锂采血管、streck无创真空采血管、空白玻璃采血管）。静置于23摄氏度室温恒温箱中保存直至开始实验。
在第0（采血后2小时内）、2、5、10、14、21日对每份样本进行如下检测：
溶血情况，检测414nmod值。计算三个样本平均值。
按照试剂盒的说明使用qiaampcirculatingnucleicacidkitcfdna提取试剂盒提取样品中的cfdna，使用qpcr方法检测样本中的cfdna总浓度，检测对象为gapdh，引物序列为：上游引物5’-gaaggtcggagtcaacgg-3’，下游引物：5’-ggaagatggtgatgggattt-3’，以基因组dna为标准品，从ct值换算cfdna总量。计算三个样本平均值。
结果如下：
表4溶血情况
结果表明，除康捷肝素锂采血管和空白玻璃采血管外，其他采血管溶血状况在21日，特别是15日内均较好，效果最好的是streck无创真空采血管以及基于edta-3k和eddha–na抗凝剂的配方9-14。
表5cfdna含量
结果表明，edta-3k配合糖类保存效果均较好，特别是edta-3k与海藻糖和山梨醇的组合。虽然eddha–na的螯合效果适合血液保存，但其中的钠离子的渗透过程对细胞损害较大（推测），单纯使用eddha–na，特别是较高浓度的eddha–na效果不佳。以一定比例组合eddha–na和edta-3k效果较好，两者比例0.8：1.5时达到最佳。上述配方中有多个在21日尺度上仍然能维持dna数量增长不超过50%，理论上应仍然可以用于cfdna相关诊断。相比之下，康捷肝素锂采血管和空白玻璃采血管在第2日上均已由于细胞破裂释放基因组dna严重干扰了cfdna数量，streck无创真空采血管在15日内效果较好，但在第20日时dna数量已经增长到初期的3倍。
实施例4：优选配方实际检测应用
将本申请的配方3、配方12的血液游离dna保存管与streck无创真空采血管一同用于肿瘤患者egfrt790m实际检测（qiaampcirculatingnucleicacidkit试剂盒提取cfdna，cobas®egfrmutationtest试剂盒检测，操作按试剂盒标准流程），共涉及42名患者，每位患者使用三种采血管采样，采血后48小时内进行首次检测，常温保存14日和21日后再进行两次检测，比较检测结果。
表6egfrt790m检测结果
除配方3组中48小时内和14日三种保存方式的检测结果一致，在第21日streck无创真空采血管出现了3例不一致（假阳性）的情况，而配方3和12检测结果仍然未改变。这初步证实了本申请配方3和12的核酸保存剂完全可以在常温下稳定血液样本中的游离核酸长达3周，检测结果仍然可靠。
此外，进行10位患者样本的低温保存实验（48小时内、14日、21日、30日），结果表明，配方12的血液游离dna保存管在4摄氏度保存30日后仍然能得到与48小时检测时相同的结果（突变：13例，无突变17例），而配方3与streck无创真空采血管分别在30日和21日时出现了2例和2例假阳性情况。配方12的血液游离dna保存管经过进一步优化和统计完全可以再次扩展使用时间范围。