一种大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法与流程

本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法。
背景技术：
：嗅球区不同于中枢神经系统的其他部位，该区具有很强的神经再生能力，原因在于这个区域存在一种特殊的胶质细胞——嗅鞘细胞（olfactoryensheathingcells,oecs），其能为受损神经组织的修复创造适宜的环境。通过oecs移植来治疗各种神经系统疾病已成为神经修复学科的一个热点。获取大量的，较高纯度的，生物活性良好的oecs，是实验研究成功的关键，也是临床应用的前提。现有技术采用人胚胎、雄性大鼠或者新生大鼠分离纯化嗅鞘细胞，但是分离培养的嗅鞘细胞单位面积密度小，生物学活性不强。技术实现要素：本发明的目的是提供一种大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法，分离培养的嗅鞘细胞数量多、密度大，生物学活性强。为了解决上述技术问题，本发明提供的大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法是这样实现的：一种大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法，包括：取怀孕中后期雌鼠，取出胚鼠，取出所述胚鼠的嗅球，剪碎所述嗅球组织，加入含血清的完全培养基，使用200目筛网过滤，吸出组织液加入离心管中离心、弃上清、重悬，重复三次；加入完全培养基调整细胞浓度，置于恒温培养箱中培养；然后使用差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。可选的，使用差速贴壁法纯化嗅鞘细胞后，再次进行差速贴壁时，在嗅鞘细胞再次贴壁后，加入阿糖胞苷抑制成纤维细胞的生长。可选的，所述使用200目筛网过滤后，使用吸管上下吹打组织液，使之成为组织悬液。可选的，所述吸出组织液加入离心管中离心为：组织液加入15ml离心管，转速1500rpm，离心10min，可选的，所述重悬使用完全培养基重悬。可选的，所述加入完全培养基调整细胞浓度到1×106个/ml，接种于无菌培养皿中。可选的，所述置于恒温培养箱中培养是置于0.5%co2、37℃恒温培养箱中培养48h。可选的，所述完全培养基为：df12培养基。可选的，所述含血清的完全培养基为：含15%胎牛血清的df12培养基。可选的，所述纯化嗅鞘细胞培养14-16天长满整个培养皿后进行鉴定。本发明提供的大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法，相对于现有技术加入酶消化组织液，细胞繁殖更快，数量更多、密度更大，对轴突延伸促进作用更明显，能更好地促进大鼠神经功能的恢复。附图说明图1是分离的胚鼠嗅球组织图；图2是本发明嗅球组织克隆团培养4天后嗅鞘细胞向外生长情况；图3是本发明嗅球组织克隆团培养4天后免疫荧光法反应后2周嗅鞘细胞生长情况；图4是本发明分离培养的嗅鞘细胞神经细胞轴突生长情况；图5是现有技术中加入胰酶进行消化分散嗅球组织的嗅鞘细胞分离培养方法分离培养的嗅鞘细胞神经细胞轴突生长情况；图6是本发明分离培养的嗅鞘细胞移植大鼠脑组织切片图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实验采用的材料和设备包括：p75小鼠单克隆抗体、gfap小鼠单克隆抗体购于英国abcam公司；胎牛血清购于美国clark公司，df12培养基购于美国hyclone公司，荧光显微镜成像系统购于日本nikon，二氧化碳培养箱购于美国thermo。本发明试验过程使用的完全培养基是df12培养基，含胎牛血清完全培养基是：含15%胎牛血清的df12培养基。本发明一种大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法，分为嗅鞘细胞的取材、嗅鞘细胞的分离培养、嗅鞘细胞纯化及鉴定，具体如下：1、嗅鞘细胞的取材1（1）取出胚鼠，雌雄大鼠合笼后，取孕13-15d怀孕中后期的雌性sd大鼠，此时胚鼠器官基本成型；使用10%水合氯醛按1ml/300g腹腔麻醉、用消毒后的手术器械打开大鼠腹腔，取出胚鼠。具体是：将冰盒内盛冰，喷75%的医用酒精，置于超净工作台内，取两个直径60mm无菌培养皿置于冰上，分别加入5ml冰pbs缓冲液；用75%酒精浸泡的棉球将胚鼠擦拭干净，然后放入盛有75%酒精的小烧杯中，浸泡约30s，取出备用。1（2）取出嗅球组织整个取材过程在超净工作台内完成，用组织剪将胚鼠断头，沿矢状缝剪开，从枕骨打孔剪至鼻部，向两侧充分暴露两侧大脑半球，用显微手术镊分离、剪下两侧的嗅球，置于盛有pbs液的培养皿中漂洗，用显微手术镊小心去除嗅球上可见的毛细血管网，漂洗干净后将嗅球放入另一个盛有pbs液的培养皿中，置于冰盒中密封好，迅速将组织转移至细胞培养间，整个操作过程需严格遵守无菌操作规程。2、嗅鞘细胞的分离培养2（1）分散嗅球组织取下的嗅球组织用pbs洗3次，用显微手术剪将嗅球组织剪碎，加入含血清的完全培养基,然后使用200目无菌筛网过滤；通过无菌网筛过滤，能够实现组织细胞分散，还可以更好地保持oecs原代细胞的活性，细胞迁出数量不受影响，细胞活性较强，能够促进神经轴突的生长；在试验过程中，发明人发现使用200目无菌筛网过滤剪碎的嗅球组织分散效果最佳。在只使用无菌筛网过滤剪碎的嗅球组织，不能很好的分散组织细胞时，可以使用软头吸管上下吹打组织液，使之成为组织悬液，达到分散组织、迁出细胞的目的。2（2）离心培养组织悬液吸出已经分散的组织液加入15ml离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，用完全培养基重悬，再次离心，重复3次。加入完全培养基，将细胞浓度调整到1×106个/ml，接种于直径60mm无菌培养皿中，置于0.5%co2、37℃恒温培养箱中培养。此时，在培养箱中培养的组织为嗅球组织克隆团，嗅球组织克隆团培养4天后，在普通光学显微镜下观察细胞形态，如图2所示，在光镜下观察到嗅球组织克隆团周边有大量梭形细胞向外迁移，迁移出的细胞大多最终分化成方向性一致的双极oecs。另外选取一部分培养4天的嗅球组织克隆团，进行p75、gfap免疫反应，次日使用dapi复染；可见少数p75、gfap免疫反应阳性的克隆球首先悬浮生长，2-3d后粘附于基底的扁平细胞表面逐渐分化；嗅球组织克隆团于一周内生长较快，随着嗅球组织克隆团增大其生长逐渐受到抑制，2周后直径最大1mm左右，嗅球组织克隆团不再生长。在此过程中，自嗅球组织克隆团周边已有梭形细胞向外迁移，迁移出的细胞大多最终分化成方向性一致的梭形oecs，荧光显微镜下拍照如图3所示，其中a：gfap抗体免疫荧光染色；b：p75抗体免疫荧光染色；c：dapi染色；d：abc合成图（400x）。３.纯化嗅鞘细胞经2（2）离心培养的细胞悬液，吸取上清中含有较多oecs的细胞悬液继续培养，使用差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。嗅球组织中含量最多的是嗅鞘细胞和成纤维细胞，而成纤维细胞贴壁速度较快，嗅鞘细胞贴壁速度较慢，将含有较多成纤维细胞的已贴壁细胞弃掉；一般经过两次差速贴壁后留下较纯的嗅鞘细胞。若纯化后的oecs鉴定后仍纯度较低，再次进行差速贴壁，在oecs贴壁后加入浓度为1×10-5mol/ml的阿糖胞苷来抑制成纤维细胞的生长。纯化后的oecs在15d后可长满整个培养皿，进行鉴定。4.oecs的鉴定纯化后的oecs培养15天后，应用4%多聚甲醛固定10min，再用pbs液洗3次，每次5min。加0.1%tritonx-100破膜10min，加pbs洗3次，每次5min，10%山羊血清室温封闭1h。加入适宜浓度的连接偶联荧光p75、gfap一抗，孵育过夜。次日使用dapi复染10min，pbs洗3次，中性树脂封片后，在荧光显微镜下观察并拍照，如图4所示，神经轴突具有明显的伸长。其中：a：gfap抗体免疫荧光染色；b：p75抗体免疫荧光染色；c：dapi染色；d：abc合成图（400x）。通常认为嗅鞘细胞的形态：未成熟的oecs常为圆形，发育成熟的oecs多为梭形，三极或多极，平行排列，突起细长；而在有血清的培养基中大多数细胞是扁平的，有少数细胞呈双极或三极并有细长突起。本发明分离的细胞是在有血清的培养基中培养的，但是从图２和图３可以看出，大部分细胞呈方向性一致的双极oecs，且嗅鞘细胞密度较大，细胞向外迁出较多；从图４和图５的对比来看，本发明分离培养的嗅鞘细胞神经轴突具有更明显的伸长；因此本发明分离培养的嗅鞘细胞嗅鞘细胞细胞形态更佳，神经轴突明显伸长、生物学更强。为了进一步说明本发明分离培养的嗅鞘细胞的生物学活性较强，本发明还进行了如下的试验：使用本发明纯化培养的oecs移植于颅脑损伤模型的大鼠损伤灶处，在14d后，我们用免疫组织化学检测大鼠的脑组织内仍有大量p75抗体表达，如图6所示，表明本发明分离的oecs可在体内存活至少2周。具体实施过程如下：101.细胞移植：手术室消毒，手术器械高压灭菌，取sd雄性大鼠10只，10%水合氯醛（1ml/300g）麻醉后将大鼠固定于立体定位仪，备皮，手术刀切开头皮，用颅骨钻于人字缝上3mm矢状缝右3mm为中心钻一半径为2.5mm的骨窗；用微量注射器吸取10μl纯化培养15天的oecx细胞悬液于骨窗处深入3mm，多点缓慢注射。最后缝合头皮，继续饲养。102.脑组织切片制作及免疫荧光检测：饲养2周后，将大鼠用10%水合氯醛麻醉，用无菌pbs进行心脏灌注，待右心耳流出的液体清亮时换成4%多聚甲醛继续心脏灌注，灌注完成后取出全脑，4%多聚甲醛溶液固定，切取细胞注射部位厚度3mm的脑组织片，酒精脱水、二甲苯透明后浸蜡、包埋，用石蜡切片机切出厚3μm的连续切片，进行p75、gfap抗体免疫荧光化学染色，中性树脂封片后于荧光显微镜下观察结果并拍照，如图6所示，可见p75、gfap均有阳性表达，表明本发明构建的oecs-nt-3可在动物体内存活，且持续时间至少2周。；图6中a：gfap抗体免疫荧光染色；b：p75抗体免疫荧光染色；c：dapi染色；d：abc合成图（400x）。为了进一步说明本发明大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法，本发明同时进行了现有技术中加入胰酶进行消化分散嗅球组织的嗅鞘细胞分离培养方法，仅在步骤2（1）中取下的嗅球组织用pbs洗3次，用显微手术剪将嗅球组织剪碎，加入0.125%的胰酶于37℃恒温箱中消化15min，然后加入含血清的完全培养基；其他步骤相同。在分离纯化的oecs培养7天后，分别对本发明分离培养的oecs和现有技术分离培养的oecs进行细胞计数仪计算，本发明和现有技术加入胰酶消化培养方法获取的oecs的数量如表1所示，从表中看出本发明分离培养的oecs数量明显较多，差异有统计学意义(p<0.01)。两种方法各取10孔细胞计数，分别计算获取细胞数，结果用均数±标准差表示。表1两种培养方法获取oecs的数量计数孔个数细胞数（`x±s）×107现有技术加入胰酶消化分离培养方法101.04±0.52本发明分离培养方法103.09±0.70同本发明一样，对现有技术加入胰酶消化分散嗅球组织的嗅鞘细胞分离培养方法分离培养的嗅鞘细胞也进行了鉴定，具体如本发明大鼠嗅鞘细胞的分离培养方法步骤4，在荧光显微镜下观察拍照，如图5所示，相对于本发明的图4神经轴突并没有明显的伸长。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12