一株六溴环十二烷高效降解菌株及其在环境修复中的应用的制作方法

本发明涉及环境生物技术领域，尤其涉及一株六溴环十二烷高效降解菌株及其在环境修复中的应用。

背景技术：

溴代阻燃剂(brominatedflameretardants，bfrs)是目前全球产量最大、阻燃效率最高的有机阻燃剂之一，广泛应用于国民生产的各个领域以及人们的日常生活中。随着溴代阻燃剂的大量生产和广泛使用，溴代阻燃剂所导致的环境问题也日益突出。其中，六溴环十二烷(1,2,5,6,9,10-hexabromocyclododecanes,hbcds)，作为溴代阻燃剂的主要代表之一，主要用于建筑材料膨胀聚苯板(eps)和挤塑聚苯板(xps)，纺织品和高抗冲聚苯乙烯(hips)中。由于hbcds具有持久性、迁移性、蓄积性，故积累到一定水平后对人体具有导致血清甲状腺激素浓度下降、抑制神经递质正常吸收、引起肝组织病理学改变等生物毒性，因此受到国际社会的高度关注。2010年8月，hbcds被欧洲化学品管理局(echa)列入“高关注度化学品清单”(epa'slistofchemicalsofconcern)(https://www.epa.gov/assessing-and-managing-chemicals-under-tsca/hexabromocyclododecane-hbcd-action-plan)。2013年5月，斯德哥尔摩环境大会将其正式列为持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,pops)。2014年5月，日本成为第一个全面实施禁止进口和生产hbcds的国家。我国是hbcds生产和消耗大国，年产量高达18,000吨，占全球产量的60％。目前，在我国各种环境样品和生物基质中都检测到不同浓度的hbcds污染，甚至在婴儿用品、食品和人体中也有检出，如奶瓶、鸡蛋和普通人群母乳。因此，高效降解环境各介质中的hbcds，对于维护人类健康和环境保护具有重要意义。

目前，降解hbcds的方法主要有光降解法、电化学降解法和生物降解法。光降解法受外界影响较大，极易被抑制，难以实现产物分离和再利用。电化学降解法存在降解效率低，能源消耗大的缺点。微生物降解法具有经济高效、绿色环保、无二次污染的优点，被认为是最具发展潜力的环境治理方法。鉴于我国的实际情况，利用微生物对hbcds进行生物降解处理具有现实意义。近年来，人们已经发现了能在好氧或厌氧条件下降解hbcd的菌群和菌株，其中降解菌株有好氧的假单孢菌(pseudomonassp.)和厌氧的反硝化菌(achromobactersp.)，但研究报道甚少。所以，开展有关hbcds降解菌株筛选、hbcds微生物分解代谢途径、生理生化性质研究，揭示微生物代谢hbcds的遗传机理，为微生物降解hbcds在相关领域的应用提供理论支持。同时，hbcds代谢机理的阐明是溴代阻燃剂脱溴机制的有力补充，为合成生物学提供新的基因元器件，利用合成生物学手段协同各元件，从而实现以hbcds为代表的难降解污染物的彻底矿化，以达到环境修复的目的。并且，在微生物代谢hbcds机理阐明的基础上，利用微生物来处理环境中的hbcds将会有更广阔的应用前景。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够高效降解六溴环十二烷的铜绿假胞菌及其在环境修复中的应用。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何在提高六溴环十二烷的降解效率的同时降低环境污染处理的成本。

为实现上述目的，本发明提供了一种六溴环十二烷高效降解菌，该菌是铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)，所述铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)于2019年2月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019094，保藏地址为中国武汉武汉大学。

进一步地，所述菌的菌体呈短杆状，能运动，无芽孢；所述菌株的菌落呈粉色，圆形，边缘无齿状，表面光滑，易被挑起；所述菌株为革兰氏阴性菌，喜好氧气；所述菌株能够以六溴环十二烷作为唯一碳源生长。

进一步地，所述菌株的菌体在液体培养基中培养时不形成生物膜。

进一步地，所述六溴环十二烷在所述菌株的液体培养基中的浓度为0.5～4.5mg/l；所述液体培养基的ph值为4.0～8.0。

进一步地，所述菌株的培养温度为25℃～37℃。

优选地，所述六溴环十二烷在所述菌株的液体培养基中的初始浓度为1mg/l。

优选地，所述液体培养基的ph值为7.0。

优选地，所述菌株的培养温度为30℃。

本发明尤其涉及铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)cctccno:m2019094的应用，比如，该菌在环境修复中的应用。

铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)cctccno:m2019094在去除环境中六溴环十二烷方面的应用。

进一步地，该应用包括以下步骤：

步骤一、采用铜绿假单胞菌hs9cctccno:m2019094；

步骤二、对铜绿假单胞菌hs9cctccno:m2019094进行培养；

步骤三、将所述步骤二培养的铜绿假单胞菌hs9cctccno:m2019094接种到含有六溴环十二烷的水体中以去除水体中的六溴环十二烷。

进一步地，所述步骤二包括斜面培养和种子培养；所述斜面培养采用含有六溴环十二烷的基础盐(minimalsaltmedium,msm)固体培养基；所述种子培养采用含有六溴环十二烷的msm液体培养基。

进一步地，所述msm液体培养基的配方是：k2hpo45.2g/l，kh2po43.7g/l，mgso40.1g/l，na2so41.0g/l和0.05％(v/v)金属离子缓冲液；

其中，所述金属离子缓冲液配方是：fecl2·4h2o0.3g/l,mncl2·4h2o0.02g/l,h3bo30.0124g/l,cucl2·2h2o0.0034g/l,cocl2·6h2o0.038g/l,zncl20.014g/l和na2moo4·2h2o0.04g/l，溶于0.1m的盐酸溶液中；

所述msm固体培养基由所述msm液体培养基和琼脂组成，其中所述琼脂的质量体积比为1.5～2.0％。

进一步地，所述msm固体培养基和/或msm液体培养基采用121℃下灭菌20分钟。

进一步地，所述斜面培养具体为：将所述步骤一中的菌株接种到含有0.5～2mg/l六溴环十二烷的msm固体培养基上，25～37℃，培养24～36小时；

所述液体培养具体为：将所述斜面培养的菌体转接到含有0.5～2mg/l六溴环十二烷的msm液体培养基中，常温下培养8～24小时，获得种子液；

所述步骤三具体为：将所述步骤二中得到的种子液中的菌体接种到含有0.5～2mg/l六溴环十二烷的所述msm液体培养基中，所述msm液体培养基的ph值为6.0～8.0，25℃～37℃，150～250转/分钟振荡培养10～20天；期间，取样，用超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测六溴环十二烷和/或其降解产物。

进一步地，所述液体培养中的常温为30℃。

进一步地，所述步骤三中的振荡培养的转速为200转/分钟；培养时间为14天；取样频率为每2天取样1次。

进一步地，所述步骤三中的超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测六溴环十二烷的条件包括：agilent1260或agilent1100高效液相色谱仪配备eclipsexdb-c18分析柱；流动相a：0.1mm乙酸钠水溶液，流动相b：100％甲醇；梯度洗脱；流速为0.25ml/分钟，检测波长为200nm，柱温为30℃；

所述梯度洗脱为：0.0～25.0分钟，流动相b的体积百分比由85％升至100％，25.0～25.1分钟，流动相b的体积百分比从100％降至85％，并维持到35分钟；或者

0.0～25.0分钟，流动相b的体积百分比由95％升至100％，25.0～25.1分钟，流动相b的体积百分比从100％降至95％，并维持到35分钟。

进一步地，所述步骤四中的种子液中的菌体浓度为在600nm下的吸光值为0.6～0.8个光密度。

本发明还涉及铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)cctccno:m2019094(以下简称铜绿假单胞菌hs9)在制备降解六溴环十二烷的制剂方面的应用。

技术效果

本发明提供了一株铜绿假胞菌hs9及其在降解去除水体中hbcds的应用。与传统菌株相比，具有以下优点：

(1)本发明中的新菌株，铜绿假胞菌hs9，能够利用hbcds作为唯一碳源和能源生长，对hbcds进行高效催化降解，从而解决环境各介质中hbcds的污染问题，达到良好的生物修复处理效果；

(2)本发明利用微生物对hbcds进行生物催化，作为催化剂成本低，反应条件温和，节省能源。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明提供的铜绿假胞菌hs9菌体形态的扫描电镜图；

图2是本发明提供的铜绿假胞菌hs9经16srrna序列分析的进化树图；

图3是本发明较优实施例1中比较培养温度对铜绿假胞菌hs9的生长及其对hbcds降解的影响；

图4是本发明较优实施例1中比较无机盐液体培养基的初始ph值对铜绿假胞菌hs9的生长及其对hbcds降解的影响；

图5是本发明所涉及的铜绿假胞菌hs9对hbcds的降解途径；

图6是本发明较优实施例3中铜绿假胞菌hs9在环境修复中的模拟应用。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本发明提供了一种能够高效分解代谢hbcds的新菌株——铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)，可通过msm无机盐培养基，以1.0mg/lhbcds作为唯一碳源进行液体培养并实现对hbcds的完全降解。在培养过程中能够检测到hbcds产物四溴环十二烯(tetrabromocyclododecene,tbcde)，二溴环十二烷二烯(dibromocyclododecadiene，dbcdi)，环十二烷三烯(cyclodecatriene，1,5,9-cdt)，五溴环十二碳醇(2,5,6,9,10-pentabromocyclododecanols，pbcdohs)。如图5所示，菌株hs9代谢hbcds有两条途径：一、通过逐步脱溴行程双键的还原脱卤；二、通过一个羟基取代一个溴的羟基化脱卤途径。该菌能在12天内，耐受并降解69％水体中1.7mg/l的hbcds，在环境污水处理中有一定的应用前景。

实施例1铜绿假单胞菌hs9的分离、鉴定及其降解hbcds的特性

1、菌株的筛选和分离

1)采取样品

土样采集地点：上海老港工业区。

2)菌株的筛选和分离

在50ml蒸馏水中溶解从不同深度采集的土样共10g，在涡旋振荡器上震荡5分钟，取5ml土壤溶液，添加到50ml无机盐液体培养基中，在培养温度30℃、转速200转/分钟的条件下培养10天。传代3～4次后，将培养液稀释并涂布在加入1.0mg/lhbcds的无机盐固体斜面培养基上，30℃下培养5～10天。挑取单菌落到新鲜的无机盐液体培养基中，选取生长最快的菌株进行划线分离，重复多次直到获得纯化的单菌。

2、菌株的鉴定

1)菌株的菌体及菌落形态特征

如图1所示，菌株的菌体呈短杆状，能运动，无芽孢；菌落呈浅粉色，圆形，边缘无齿状，表面光滑，易被挑起；在液体培养基中培养时不会形成生物膜。

2)菌株的生理生化特征

菌株为革兰氏阴性菌，喜好氧气，能够以hbcds作为唯一碳源生长。

上述菌学特征与文献(常见细菌鉴定手册)编录的甲基杆菌属的生理生化性状相吻合。菌株经16srrna序列的系统发育研究，如图2所示，和甲基杆菌属亲缘关系最近。结合以上的生理生化的菌学特征和进化树分析，将其鉴定为铜绿假单胞菌hs9(pseudomonasaeruginosahs9)。

3、培养条件对铜绿假单胞菌hs9的生长及其降解hbcds能力的影响

1)培养温度的影响

将2.5ml种子液接种到50ml含有hbcds(1mg/l)的msm液体培养基中，在转速为200转/分钟的培养条件下，比较在不同培养温度(25℃，30℃和37℃)的情况下，菌株的生长和hbcds的降解。如图3所示，菌株在37℃以下都能生长，并能较快地降解hbcds。其中，最适合菌株生长和hbcds降解的培养温度为30℃。

2)初始ph的影响

将2.5ml种子液接种到50ml含有hbcds(1.0mg/l)的msm液体培养基中，在培养温度为30℃、转速为200转/分钟的培养条件下，使用盐酸和氢氧化钠对培养基的ph值进行调整，比较在不同初始ph(6.0，7.0和8.0)的情况下，菌株的生长和hbcds的降解。如图4所示，菌株在ph6.0～8.0时都能较快地降解hbcds。其中，最佳的菌株生长和hbcds降解的ph值为7.0。

3)hplc-ms/ms法检测hbcds的含量

hplc-ms/ms的检测条件是：agilent1100高效液相色谱仪配备eclipsexdb-c18分析柱；流动相a：0.1mm乙酸钠水溶液，流动相b：100％甲醇；洗脱梯度：0.0～25.0分钟，流动相b比例由85％(v/v)升至100％(v/v)，25.0～25.1分钟，流动相b比例从100％(v/v)降至85％(v/v)，并维持到35分钟；流速为0.25ml/分钟，检测波长为200nm，柱温为30℃。

使用hplc-ms/ms定量检测hbcds浓度，配制不同浓度梯度的hbcds标准品，测定相应浓度下的峰面积，绘制标准曲线。将待测样品稀释到合适浓度后，用提取粒子色谱仪(eic)检测获得m/z→79，m/z→640.3下的峰面积，再由标准曲线换算出其hbcds浓度。

实施例2铜绿假单胞菌hs9降解hbcds的中间代谢产物分析

1、铜绿假单胞菌hs9的培养

将15ml菌悬液接种到1l含有hbcds(1.0mg/l)的msm液体培养基中，培养温度30℃，转速200转/分钟，进行培养。待菌株生长进入平台期后期时，收集菌体进行休止细胞反应。

加入hbcds(1.0mg/l)作为底物进行休止细胞反应，在反应进行0～24小时中，分别取培养物10ml，8000转/分钟下离心10分钟，温度为4℃，收集上清液进行萃取，用于后续气相色谱-质谱联用(gc-ms)及hplc-ms分析。

2、样品制备过程及色谱条件

1)样品制备

在1ml样品中加入10μlhcl终止反应，减少吸附作用引起的萃取效果低。涡旋振荡仪振荡30秒后，在12,000转/分钟下离心5分钟，取500μl上层有机相，使用浓缩仪浓缩至干燥后，用30μl乙酸乙酯重悬。

2)gc-ms检测条件

气相色谱(agilent6850/5975c)进样口和检测器温度为280℃，氦气流量为1ml/分钟，柱前压力50kpa。

升温过程为：初始温度70℃，保持3分钟；以15℃/分钟的速率从70℃升温至260℃；再以20℃/分钟的速率从260℃升温至280℃，并保持10分钟。

如图5所示，gc-ms可检测到四溴环十二烯(tetrabromocyclododecene，tbcde)，二溴环十二烷二烯(dibromocyclododecadiene，dbcdi)和环十二烷三烯(cyclodecatriene，1,5,9-cdt)。同时能够检测到以cdt为唯一碳源休止细胞反应产物1,2-环氧基-5,9-环十二碳二烯(1,2-epoxy-5,9-cyclododecadiene，ecdd)。

3)hplc-ms/ms检测条件

agilent1100高效液相色谱仪配备eclipsexdb-c18分析柱(150μm×4.6μm,粒径5μm)；流动相a:0.1mm乙酸钠水溶液，流动相b：100％甲醇；梯度洗脱：0～25分钟，流动相b比例由95％(v/v)升至100％(v/v)，25.1分钟流动相b比例100％(v/v)降至95％(v/v)，并维持10min，流速0.25ml/min，检测波长200nm，柱温30℃。电喷雾离子化(esi)为负离子模式。

如图5所示，hplc-ms/ms可以检测到hbcds代谢过程中羟基化脱卤产物五溴环十二碳醇(2,5,6,9,10-pentabromocyclododecanols，pbcdohs)。

实施例3铜绿假单胞菌hs9在环境修复中的模拟应用

由于实际污染环境通常较为恶劣，因此，为了模拟铜绿假单胞菌hs9在废水中去除hbcds的应用，已测试了菌株对培养温度和培养液初始ph的适应范围(初始hbcds浓度1.7mg/l，200转/分钟振荡培养)。如图3所示，菌株在培养温度为25℃～37℃时，都能较快地降解hbcds。如图4所示，菌株在ph值为6.0～8.0的无机盐液体培养基中，都能较快地降解hbcds。其中，当ph值为7.0时，hbcds的降解速度最快；当ph值为6.0或8.0时，菌株对hbcds的降解速率降低。在最适条件30℃ph7.0条件下，如图6所示的模拟应用，菌株可在12天内实现对1.7mg/lhbcds的69％降解，具有很好的降解率和降解速度。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。