一种基因载体及其制备方法与流程

本发明涉及基因载体技术领域，特别涉及一种基因载体及其制备方法。

背景技术：

基因治疗的成功除了需要安全、有效的目的基因外，如何将目的基因导入细胞内成功表达也极为重要。裸露的外源基因dna难以进入细胞且容易被机体或细胞降解，因而难以表达，所以需要具有高转染率及低毒性的载体协助目的基因进入靶细胞，这里，用于转运目的基因进入靶细胞的载体即为基因载体。

无机纳米粒子可以通过吸附核酸形成纳米材料与核酸复合物，从而保护dna分子免受核酸酶的降解，是目前较为常见的一类非病毒基因载体，但无机纳米粒子具有较大的细胞毒性，而且大部分无机纳米粒子在长时间放置后，稳定性会降低，且容易产生团聚，从而导致其失去物理和化学特性。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提出一种基因载体及其制备方法，旨在制备一种基因载体，该基因载体稳定性好、细胞毒性小。

为实现上述目的，本发明提出一种基因载体，所述基因载体包括磁核和包覆在所述磁核表面的单宁酸薄膜；

其中，所述磁核为磁性纳米粒子四氧化三铁。

此外，本发明还提出了一种基因载体的制备方法，用于制备上述基因载体，所述基因载体的制备方法包括以下步骤：

将无水氯化铁和无水乙酸钠加入到乙二醇中，加热搅拌形成透明溶液；

将所述透明溶液置于高压釜中，加热至形成磁性纳米粒子；

将所述磁性纳米粒子、氯化铁和单宁酸溶于水中，形成混合溶液；

调节混合溶液呈中性后，搅拌至单宁酸薄膜充分包覆在所述磁性纳米粒子表面，经磁分离、洗涤、干燥后，得基因载体。

优选地，将无水氯化铁和无水乙酸钠加入到乙二醇中，加热搅拌形成透明溶液的步骤中，

所述无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1：(1～2)：(0.5～2)。

优选地，将无水氯化铁和无水乙酸钠加入到乙二醇中，加热搅拌形成透明溶液的步骤中，所述加热搅拌时，加热温度为50～60℃。

优选地，将所述透明溶液置于高压釜中，加热至形成磁性纳米粒子的步骤中，

所述高压釜为聚四氟乙烯高压釜；和/或，

所述加热时，温度为180～220℃；和/或，

所述加热时间为12～24h。

优选地，将所述透明溶液置于高压釜中，加热至形成磁性纳米粒子的步骤包括：

将所述透明溶液置于高压釜中，于恒定温度下加热反应形成反应溶液；

待反应结束后，用钕铁硼磁铁对所述反应溶液进行磁分离，经洗涤得磁性纳米粒子。

优选地，将所述磁性纳米粒子、氯化铁和单宁酸溶于水中，形成混合溶液的步骤中，所述磁性纳米粒子、氯化铁和单宁酸的重量比为(40～50)：(5～15)：(30～50)。

优选地，调节混合溶液呈中性后，搅拌至单宁酸薄膜充分包覆在所述磁性纳米粒子表面，经磁分离、洗涤、干燥后，得基因载体的步骤中，

所述搅拌时，搅拌时间为24～28h；和/或，

所述搅拌时，搅拌转速为200～500r/min；和/或，

所述搅拌时，搅拌方式为机械搅拌。

本发明技术方案中，以磁性纳米粒子四氧化三铁为骨架，在其表面包覆单宁酸薄膜，制成基因载体，由于单宁酸具有低细胞毒性，通过利用功能化单宁酸对磁性纳米粒子四氧化三铁进行表面功能化修饰，有效降低了制成的基因载体的细胞毒性，且由于磁性纳米粒子四氧化三铁被薄膜包覆，从而提高了磁性纳米粒子四氧化三铁的稳定性，降低了其团聚的可能性，且本发明提供的制备方法也极为简便且易于操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的基因载体的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为各实施例制得的基因载体的转染效果检测的荧光显示图；

图3为各实施例制得的基因载体的dna凝聚检测的凝胶电泳图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

无机纳米粒子可以通过吸附核酸形成纳米材料与核酸复合物，从而保护dna分子免受核酸酶的降解，是目前较为常见的一类非病毒基因载体，但无机纳米粒子具有较大的细胞毒性，而且大部分无机纳米粒子在长时间放置后，稳定性会降低，且容易产生团聚，从而导致其失去物理和化学特性。

鉴于此，本发明提出一种基因载体，所述基因载体包括磁核和包覆在所述磁核表面的单宁酸薄膜；

其中，所述磁核为磁性纳米粒子四氧化三铁。

磁性纳米粒子四氧化三铁为一种无机纳米粒子，具有较大的比表面积，可以装载大尺寸dna，且具有超顺磁性，在外加磁场作用下，可以促使其运送其携带的dna移动到靶细胞，具有高转染效率。单宁酸具有低细胞毒性，通过利用功能化单宁酸对磁性纳米粒子四氧化三铁进行表面功能化修饰，可以有效降低制成的基因载体的细胞毒性并进一步提高该基因载体的转染效率，且由于磁性纳米粒子四氧化三铁被薄膜包覆，从而提高了磁性纳米粒子四氧化三铁的稳定性，降低了其团聚的可能性，是一种优质的基因载体，解决了上述无机纳米粒子细胞毒性大、稳定性差的缺陷。

为此，本发明还提出了一种基因载体的制备方法，用于制备上述基因载体，结合图1所示的基因载体的制备方法的一实施例的流程示意图，所述基因载体的制备方法包括以下步骤：

步骤s10、将无水氯化铁和无水乙酸钠加入到乙二醇中，加热搅拌形成透明溶液。

步骤s20、将所述透明溶液置于高压釜中，加热至形成磁性纳米粒子。

步骤s10中，所述无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1：(1～2)：(0.5～2)；所述加热搅拌时，加热温度为50～60℃。

步骤s20中，所述高压釜为聚四氟乙烯高压釜；所述加热时，温度为180～220℃；所述加热时间为12～24h。

无水氯化铁和无水乙酸钠在溶剂乙二醇中经高温加热反应生成一定浓度的亚铁离子和铁离子，并进一步结合生成四氧化三铁颗粒。原料的投入量、反应时的温度和反应时间都会直接影响到产物的品质，因此，在步骤s10中，所述无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比优选为1：(1～2)：(0.5～2)；所述加热搅拌时，加热温度优选为50～60℃；搅拌方式可以是机械搅拌，也可以是磁力搅拌；在步骤s20中，所述加热时，温度优选为180～220℃；所述加热时间优选为12～24h。

此外，由于高温高压可以改善产物的结晶性和磁性能，因此，在本实施例中，反应容器选用高压釜，且优选为聚四氟乙烯材质的高压釜。

而在步骤s20实施时，在本发明的另一实施例中，该步骤可以包括：

步骤s210、将所述透明溶液置于高压釜中，于恒定温度下加热反应形成反应溶液；

步骤s220、待反应结束后，用钕铁硼磁铁对所述反应溶液进行磁分离，经洗涤得磁性纳米粒子。

反应溶液中包含了磁性纳米粒子四氧化三铁和其他杂质，利用磁性纳米粒子四氧化三铁的磁性能，即能使用磁铁将其从反应溶液中分离出来，在本实施例中，磁分离所需要的磁铁优选为具有强磁性的钕铁硼磁铁，可以进一步提高分离效率。

步骤s30、将所述磁性纳米粒子、氯化铁和单宁酸溶于水中，形成混合溶液。

其中，所述磁性纳米粒子、氯化铁和单宁酸的重量比为(40～50)：(5～15)：(30～50)

步骤s40、调节混合溶液呈中性后，搅拌至单宁酸薄膜充分包覆在所述磁性纳米粒子表面，经磁分离、洗涤、干燥后，得基因载体。

其中，所述搅拌时，搅拌时间为24～28h；所述搅拌时，搅拌转速为200～500r/min；所述搅拌时，搅拌方式为机械搅拌。

在中性条件下，即混合溶液的ph为7～8时，随着不断搅拌，单宁酸逐渐包覆在磁核表面，完成对磁核的表面功能化修饰，而单宁酸具有低细胞毒性，当单宁酸对磁性纳米粒子四氧化三铁完成包覆时，磁核的细胞毒性也得以有效降低，且由于磁核被薄膜包覆，提高了磁核的稳定性，降低了磁核发生团聚的可能性，因此，制得的基因载体具有低细胞毒性和高稳定性。

在单宁酸包覆磁核这一过程中，搅拌方式和搅拌速度对所得产物的微观形态影响较大，经发明人发现，搅拌方式为机械搅拌时，对比磁力搅拌，所得产物的分散性更好，粒径更小且粒径分布更窄，因此，在本实施例中，所述搅拌时，搅拌方式优选为机械搅拌；搅拌速度越快，所得产物的粒径越小，粒径分布越窄且团聚现象减弱，但搅拌速度过大时，所得产物反而会出现粒径不再变小，甚至变大的现象，因此，在本实施例中，所述搅拌时，搅拌转速优选为200～500r/min。

此外，从上述步骤，也可以看出，本发明提供的制备方法步骤少，反应条件易于达成，生产成本较低，市场竞争力强。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1:0.5)，于50℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于220℃温度下加热12h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取440mg上述磁性纳米粒子、100mg三氯化铁和400mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以200r/min转速机械搅拌28h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例2

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.2:0.8)，于55℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于180℃温度下加热24h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取400mg上述磁性纳米粒子、50mg三氯化铁和300mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以500r/min转速机械搅拌24h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例3

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.4:1)，于57℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于200℃温度下加热14h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取500mg上述磁性纳米粒子、150mg三氯化铁和500mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以300r/min转速机械搅拌25h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例4

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.5:1.2)，于60℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于190℃温度下加热22h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取420mg上述磁性纳米粒子、80mg三氯化铁和350mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以400r/min转速机械搅拌26h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例5

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.6:1.5)，于53℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于210℃温度下加热20h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取470mg上述磁性纳米粒子、120mg三氯化铁和450mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以220r/min转速机械搅拌27h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例6

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.8:1.7)，于59℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于205℃温度下加热18h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取490mg上述磁性纳米粒子、140mg三氯化铁和480mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以250r/min转速机械搅拌25.5h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例7

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:2:1.8)，于52℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于215℃温度下加热16h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取410mg上述磁性纳米粒子、60mg三氯化铁和330mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以350r/min转速机械搅拌24.5h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

实施例8

称取无水氯化铁和无水乙酸钠置于乙二醇中(无水氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.5:2)，于54℃下，恒温搅拌至形成透明溶液；将透明溶液转移至聚四氟乙烯高压釜中，于200℃温度下加热15h，待反应结束后，用钕铁硼磁铁对反应溶液进行磁分离，用乙醇对分离出的黑色的四氧化三铁纳米颗粒进行洗涤，去除其表面残留的试剂，即得磁性纳米粒子，备用。

称取430mg上述磁性纳米粒子、90mg三氯化铁和380mg单宁酸，加入到200ml水中，溶解得混合溶液；调节混合溶液ph至7.5后，以480r/min转速机械搅拌275h，然后对混合溶液进行磁分离，得到磁性纳米粒子与单宁酸的复合物，用纯水洗涤复合物表面，然后干燥，得基因载体。

对实施例1～8制得的基因载体进行检测，检测项目包括：转染效果检测；dna凝聚效果检测；以及，细胞毒性检测。具体检测过程及结果如下：

(一)转染效果检测

将实施例1～8制备的基因载体按照以下方法进行实验：

将基因载体与增强绿色荧光蛋白按质量比为5:1混合，孵育40分钟后，再与hek-293t细胞共同培养4小时，然后用新鲜的含10％胎牛血清的培养液继续培养48小时，使用荧光显微镜在蓝光激发下观察增强绿色荧光蛋白的表达情况并记录在图2中。

参阅图2可知，各实施例分别对应的小图均显示多个绿色荧光(表示为图2中的多个亮点)，说明增强绿色荧光蛋白可以在细胞内实现表达，说明本发明提出的基因载体能实现转染，可以作为有效的基因递送载体。

(二)dna凝聚效果检测

取实施例1～8制得的基因载体各0.05g，溶于10ml水中，作为样品溶液。

将样品溶液和质粒dna按不同质量比混合(0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1)，反应40min后加入上样缓冲液，形成点样溶液。取点样溶液进行琼脂糖凝胶电泳，其中凝胶为1％琼脂糖凝胶，电泳仪的电压为90v，电流为120ma。同时设置裸dna对照。电泳结束后，用溴化乙锭(eb)染色凝胶，使dna条带显示，然后用凝胶成像仪观察并拍照，其凝胶电泳图如图3所示，其中，每张对应一实施例的小图中的六条条带从左至右依次对应裸dna对照组、0.5:1质量比、1:1质量比、2:1质量比、4:1质量比、8:1质量比。

从图3可以看出，随着质量比增大，即基因载体浓度增大，点样溶液的滞留程度越大，说明基因载体与dna结合从而将dna滞留在凝胶孔中，即本发明提出的基因载体可以顺利与dna凝聚。

(三)细胞毒性检测

采用噻唑蓝(mtt)比色法对实施例1～8中制备的基因载体的安全性进行评价。

将各实施例制备的基因载体分别制成不同浓度的样品溶液(5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l)，然后按照下述方法进行检测：

将样品溶液与a2780细胞(人卵巢癌细胞)共同孵育24小时后，加入mtt溶液(0.5mg/ml)继续培养4小时，吸取培养液，加入二甲基亚砜，使用酶标仪测定570nm处的吸光度，并计算细胞的存活率，结果如表1所示。

表1各实施例制得的基因载体不同浓度时a2780细胞的存活率

由表1可以看出，在浓度达到30mg/l时，各实施例制备的基因载体细胞存活率仍在80％以上，说明本发明制备的基因载体的无明显的细胞毒性，具有较高的安全性。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。