基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台的制作方法

本发明属于dna测序的光学装置技术领域，尤其涉及一种基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现dna测序的仪器平台。

背景技术：

对于每个生物个体而言，基因组包含了整个生物体的遗传信息。基因测序技术能够真实地反映一个染色体上的全部遗传信息，进而可以全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因此在生命科学研究中，基因测序扮演着一个十分重要的角色。基因测序技术最早可追溯到20世纪50年代，早在1954年whirfeld等人就己经提出了测量多聚核糖核苷酸的化学降解法。该方法主要是利用磷酸单脂酶的脱磷酸作用以及高碘酸盐的氧化作用将寡核糖核苷酸从链末端逐一分离并测定其种类。但是由于其操作的复杂性，该方法并没有被广泛应用。1977年，sanger等人提出了经典的双脱氧核糖核苷酸末端终止测序法，该方法的原理是根据双脱氧核苷酸（ddntp）的2’和3’上都不带有羟基，在dna的合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断dna的合成反应。在4个dna合成反应体系中分别加入一定比例的具有放射性分子的dna序列。尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其测试的成本太高、速度太慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法而且不适宜大众化。2005年第一次出现了大规模的并行聚合测序仪器，引领了高通量基因测序的新时代，以roche公司的454技术、illumina公司的solexa技术和abi公司的solid技术的出现为标志了第二代基因测序技术的诞生。第二代基因测序技术不仅仅保持了一代测序技术的高准确度，而且大大降低了基因测序的成本同时极大地提高了测序的速度。但是第二代基因测序技术也存在一定的缺陷，它所能测量的dna长度较短。随着生物化学、生物物理学、电子学等学科的迅速发展，基于单分子检测的纳米孔测序方法应运而生。基于纳米孔的单分子dna测序方法，是下一代即第三代基因测序技术中成本最低，最具有竞争力的技术，该方法的原理是首先构造一个纳米孔，当dna分子通过纳米孔时，由于dna分子的物理占位，将会引起纳米通道的电阻变化，电阻的变化将导致基准离子电流的变化，形成类似于方波信号的调制电流信号，调制电流信号的波形与生物分子对应的物理信息直接相关。该方法使得dna测序的速度大大提高，时间大大降低，但该方法的可靠性依赖与纳米孔的可靠与稳定制备，使得该方法的准确性和可靠性不易控制。近年来，针尖增强拉曼技术的发展使得直接通过拉曼光谱识别和研究单分子成为可能。基于此，我们提出一种基于针尖增强拉曼的dna测序平台。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明公开了基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现dna测序的仪器平台，该平台一方面利用非接触式光学检测技术提高检测可靠性，另一方面利用针尖近场增强效果显著提高单各位点光谱的空间分辨率，实现亚纳米尺度dna碱基光谱信号的直接获取。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现dna测序的仪器平台，利用耦合原子力显微镜测量系统的纳米级空间分辨率技术和拉曼测量系统的超灵敏化学结构探测技术实现dna样品的表面形貌表征及原位点dna碱基信号获取；保持纳米级半径的扫描探针针尖与单晶金基底之间间距在3纳米以下，激光激发的针尖和基底上的局域表面等离子体发生共振耦合，使得针尖与金基底形成的纳米间隙内的局域电磁场显著增强到10⁸-10¹²数量级，此时处于该受限空间的dna的光学拉曼信号得到增强，同时空间分辨率提高到亚纳米尺度。拉曼光谱作为一种分子指纹光谱随着分子结构变化而变化，dna中四种不同碱基所产生的针尖增强拉曼光谱各不相同。通过采集dna链上不同位点的针尖增强拉曼光谱，并与标准碱基光谱作对比获取测量位点处拉曼光谱的产生来源，从而确定该测量位点处的碱基分子信息。通过大面积快速面扫描技术，实现单个dna链的全空间针尖增强拉曼光谱采集，再利用数据处理，分析，比对技术，得到dna中碱基的空间分布信息，实现dna序列的直接获取。其中针尖与激发激光的耦合同轴是针尖增强拉曼测量的关键技术之一。首先通过纳米级压电驱动台控制样品与上部原子力显微镜模块中的针尖，保证针尖与样品之间距离在1~3纳米，然后通过倒置物镜实现激光入射，而入射激光的焦点与针尖的同轴通过连接在物镜底座上的压电驱动台实现。通过测量物镜移动时反射激光信号的强弱判断是否实现激光与针尖的对准。因为当针尖恰好处于激光光斑中心时，由针尖产生的反射信号最强，当物镜聚焦的激光光斑与原子力显微镜的针尖对准完成后，保持针尖与底部物镜的相对位置不变，通过移动中间的样品实现大面积光谱扫描。

本发明的有益效果是：

本发明采用非接触式光学测量技术，耦合原子力显微技术与拉曼光谱技术实现超高空间分辨率和超灵敏化学结构信息的同时测量，即针尖增强拉曼测量技术，既保证dna测量过程中对dna试验品的无损检测，又实现dna碱基信号的可靠区分，测量精度高，速度快，成本相对较低。

附图说明

图1是本发明的dna测序平台总体图；

图2是本发明所述的原子力显微镜针尖与拉曼激光对准正视图；

图3是本发明所述的原子力显微镜针尖与拉曼激光对准俯视图；

图4是四种不同碱基拉曼光谱比对图示；

图5是针尖增强拉曼实现dna序列成像图；

图6是dna的典型的针尖增强拉曼光谱。

附图标记列表：

1.原子力显微镜模块，2.样品台控制模块，3.拉曼光谱采集模块，4.计算机控制的图像采集、处理及显示模块，5.dna试验品，6.压电驱动位移平台，7.惯性电机驱动的大行程位移平台，8.带针尖的微悬臂，9.二极管激光器，10.四象限光电传感器，11.信号差分放大器，12.针尖运动的反馈控制器，13.压电陶瓷扫描器件，14.压电扫描信号发生器，15.光谱及力学成像，16.白光照明光路，17.白光采集成像光路，18.白光光源，19.半透半反镜一，20.倒置物镜，21.半透半反镜二，22.ccd相机，23.半透半反镜三，24.金三角，25.拉曼激发光路，26.拉曼信号采集管路，27.633纳米激光器，28.激光准直镜，29.聚焦镜，30.共聚焦小孔，31.光谱仪，33.倒置物镜压电驱动台，34.增益反馈，35.参考电压信号，36.dna样品，37.云母片基底，38.拉曼入射激光束，39.微悬臂上针尖。

具体实施方式

如图所示，本发明所述的基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现dna测序的仪器平台，主要由四部分构成：原子力显微镜模块1、样品台控制模块2、显微共聚焦拉曼光谱测量模块3和计算机控制的图像采集、处理及显示模块4。四个模块共同耦合工作，实现dna样品的测量。显微共聚焦拉曼光谱测量模块3及联动原子力显微镜模块1采用德国witec公司集成化的型号为alpha300ra产品，样品台控制模块2包含x,y方向压电驱动的高精度位移平台6和惯性电机驱动的大行程位移平台7。惯性电机驱动的大行程位移平台的最大工作行程为2500微米，精度为100纳米；压电驱动的高精度位移平台最大工作行程为50微米，精度为1纳米。其中压电驱动位移平台通过螺栓固定到惯性电机驱动的大行程位移平台7上，保证两者工作相互独立。所述压电驱动的高精度位移平台6和惯性电机驱动的大行程位移平台7中间设有圆孔，dna试验品5制备完成后，dna试验品5通过双面胶固定到圆孔上，以确保光谱采集过程中，载物台不干扰物镜20工作。所述dna试验品5下方为云母片基底37，云母片基底37上方设有金三角24，金三角24表面设有dna样品36；云母及纳米级厚度的金三角在可见光波段为透明，不干扰dna信号的采集。

由于dna分子尺寸很小，直径2纳米左右，无法通过光学显微镜直接观察和定位dna分子，所以，首先利用原子力显微镜模块1实现dna试验品的寻找和表征。原子力显微镜模块主要由带针尖的微悬臂8；微悬臂运动检测装置包括二极管激光器9和四象限光电传感器10、信号差分放大器11、控针尖运动的反馈控制器12；dna试验品进行扫描的压电陶瓷扫描器件13；压电扫描器件控制的信号发生器14以及计算机控制的图像采集、处理及显示模块4等。原子力显微镜的基本原理是：二极管激光器9发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂8背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的四象限光斑位置检测器10。在dna试验品扫描时，由于dna试验品表面的原子与微悬臂探针尖端39的原子间的相互作用力，微悬臂将随样品表面形貌而弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测dna试验品表面形貌的信息。在系统检测成像全过程中，扫描探针39和被测dna样品36间的距离始终保持在纳米量级，反馈回路12和信号放大电路11的作用就是在工作过程中，由探针得到探针与dna试验品相互作用的强度，来改变加在样品扫描器13垂直方向的电压，从而使压电管伸缩，调节探针和被测dna试验品间的距离，反过来控制探针与dna试验品相互作用的强度，实现反馈控制，得到dna试验品表面形貌信息及力学信息15。

原子力显微镜模块超高的空间分辨率取决于微悬臂8的针尖39半径。为了获得高空间分辨率的同时获得良好的等离子体光学响应，采用奥林巴斯公司生产的半径为5纳米左右的商业化硅探针，进行热蒸镀沉积5纳米镍，然后再沉积30纳米金。针尖上的金膜用以实现局域表面等离子体激发，提高局域电磁场，从而提高拉曼光谱信号。

完成原子力显微镜模块后，便可通过样品台控制模块2移动dna试验品，保证针尖39恰好位于金三角上吸附的dna的上方，如图2所示。然后，需要将拉曼测量系统3耦合到原子力显微镜模块1。拉曼测量系统相对独立，主要包含两个个部分，图像采集光路及拉曼测量光路。

图像采集光路主要包括白光照明光路16和白光采集成像光路17。白光照明光路16主要由白光光源18和半透半反镜一19组成，白光光源18发出的白光经过半透半反镜一19反射，再经过倒置物镜20聚焦到dna试验品5上。白光采集成像光路17主要包括半透半反镜二21和一个ccd相机22。白光照射样品反射回来的信号经三个半透半反镜21，23和19反射进入到ccd相机22，实现图像采集。由于100倍物镜下可以清晰看到1微米尺寸的金三角24，所以可以通过该白光照明光路16、白光采集成像光路17及惯性电机驱动的大行程位移平台7实现样品的初步寻找和定位。

拉曼测量光路包含拉曼激发光路25和拉曼信号采集光路26。拉曼激发光路25中，首先633纳米激光器27出射激光束经准直镜28准直，透射过三个半透半反镜21，23和19后经由圆孔处的倒置物镜20聚焦到dna试验品5上。激光与样品相互作用后产生拉曼散射光，经由半透半反镜一19透射和半透半反镜三23反射进入到拉曼信号采集光路26。反射后的拉曼散射光经由聚焦镜29聚焦通过共聚焦小孔30后进入到光谱仪31中，实现拉曼信号的采集。共聚焦小孔30的作用在于实现共聚焦拉曼测量，可以提高空间分辨率。

针尖增强拉曼测量需要原子力显微镜的针尖与拉曼测量系统的物镜聚焦后的拉曼入射激光束38同轴，也就是要求原子力显微镜的针尖位于激光光斑的中心。由于针尖的直径在20纳米以下，无法利用拉曼测量模块3中白光照明光路16和白光采集成像光路17直接成像，需要借助拉曼激发光路25和拉曼信号采集光路26。当针尖位于激光光斑中心时，此时由针尖产生的瑞利散射光强度应最大，这样，通过倒置物镜压电驱动台33移动调节物镜的位置，找到瑞利散射光强度最大的位置，实现拉曼测量模块3与原子力显微镜模块1的耦合，实现针尖增强拉曼系统的构建（倒置物镜压电驱动台中部也有圆孔，便于光透过）。然后保持针尖39相对物镜20的位置不变，针尖39与拉曼显微测量拉曼入射激光束38同轴联动，通过移动样品台2上压电驱动单元6，实现dna针尖增强拉曼光谱和表面形貌的同时测量。图2为校准完成后，原子力显微镜的针尖与拉曼测量系统的物镜聚焦后的拉曼入射激光束38同轴实时原位测量dna36的示意图。

图2中微米尺度单晶金三角采用化学合成的方法生长，金三角边长为微米级而厚度仅为10~20纳米。首先，将60毫升0.83毫摩尔每升的柠檬酸钠溶液及40毫升二元溶液包含1.25毫摩尔每升氯金酸及7.5毫摩尔每升十六烷基三甲基溴化铵分别加热到50摄氏度，然后将二元溶液全部加入到60毫升柠檬酸钠溶液中充分搅拌并缓慢加热到82摄氏度，继续保持82摄氏度搅拌半个小时，将反应完成的溶液冷却至室温，便得到100毫升金三角悬浊液。将金三角悬浊液离心旋涂（3000转每分钟）到原子级光滑的云母表面；然后在真空干燥箱中干燥6小时，接着将吸附有金三角的云母片浸泡在70摄氏度的超纯水中30分钟以去除表面吸附物，然后用氮气吹干，最后，以清洗后的吸附在云母片基底上的金三角为基底，将待测dna样品稀释后滴涂到该基底上，dna以物理吸附的方式吸附到金三角上。其中云母及纳米级厚度的金三角在可见光波段为透明，不干扰光路传导及dna信号的采集。

dna主要由四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶组成，dna测序的基本要求就是对dna中的这四种碱基进行区分。图4为dna中四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的拉曼光谱，图中的a、b、c、d分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，不同碱基之间的拉曼光谱有显著区别，本发明分别用位于723cm^-1,647cm^-1,788cm^-1,1365cm^-1波数的特征峰特异性识别dna中的四种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。

图5中，通过对dna上特定点的针尖增强拉曼光谱进行谱峰比对与筛选，得到该特定点的碱基信息，图6典型的dna的针尖增强拉曼光谱。图中的a和b分别为来自单链dnatgacgacggagggcatccta和ccctccactcacactacctc的针尖增强拉曼光谱。利用大面积扫面成像技术，便可获得整个扫描区域碱基序列的空间排布，实现dna快速，准确序列测量。