本发明属于药物领域，具体涉及一种具有idh突变体抑制活性的均三嗪类化合物或其药学上可接受的盐、药物组合物、及其制备方法、以及它们作为异柠檬酸脱氢酶2突变体(midh2)抑制剂的用途。
背景技术：
：三羧酸循环是人体内糖类、脂类和氨基酸三大营养素的共同代谢通路，不仅是机体获取能量的主要方式，同时还为其它物质的生物合成提供重要的小分子前体。因此，三羧酸循环具有重要的生理意义。三羧酸循环由一系列酶促反应所构成。其中，异柠檬酸脱氢酶(idh)是三羧酸循环中的关键限速酶，负责催化异柠檬酸转化成α-酮戊二酸(α-kg)。人体内存在3种idh同工酶，其中idh1定位于细胞质和过氧化物酶体，而idh2和idh3则定位于线粒体内。不同的idh亚型具有各自生理功能，但总体而言它们在能量代谢、生物合成和抗氧化胁迫等过程中发挥重要作用(aminoacids,2017,49(1):21-32)。idh催化生成的α-kg除了参与三羧酸循环外还是体内多余种双加氧酶的辅助因子，因此对维护机体生理功能起着重要的作用。其中，这些双加氧酶包括与肿瘤的发生紧密相关的含jmjc域的组蛋白去甲基化酶以及5-甲基胞嘧啶羟化酶tet家族。它们能够调控组蛋白和dna的去甲基化过程，从而影响dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式，最终改变基因的表达(cancerlett,2015,356(2):309-314)。快速增殖是肿瘤细胞最突出的生物学特征，而代谢异常则是其另一基本特性。在肿瘤发生过程中，细胞代谢网络需要通过重编程来平衡能量需求和生物合成需要，以利于合成各种细胞结构所需的生物大分子，从而来满足细胞的快速增殖。因此代谢重编程在遗传事件导致细胞恶性转化过程中扮演重要的角色(neuropathology,2019,39(1):3-13.)。目前已发现idh1和idh2基因突变与人类肿瘤关系密切。2008年，美国约翰·霍普金斯大学parsons等人最先在胶质瘤患者中发现idh基因突变现象(science,2008,321(5897):1807-1812)。随后人们陆续在结肠癌(oncogene,2010,29(49):6409-6417)、急性髓性白血病(blood,2010,116(12):2122-2126)、软骨肉瘤(jpathol,2011,224(3):334-343)、黑色素瘤(amjpathol,2011,178(3):1395-1402)、胆管癌(oncologist,2012,17(1):72-79)、乳腺癌(expertrevmoldiagn,2018,18(12):1041-1051)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(cancerdiscov,2013,3(7):730-741)、甲状腺癌(oncogene,2012,31(19):2491-2498)和前列腺癌(oncogene,2012,31(33):3826)等一系列肿瘤患者中检测出idh1和idh2突变。大量研究表明，idh1和idh2基因突变在人类肿瘤发生与发展中起重要的作用，这主要与其催化产生的致癌代谢产物有关。临床研究表明，肿瘤患者的idh突变主要发生在idh1和idh2活性位点中的关键氨基酸残基。idh1的突变主要发生于r132位，其中以r132h的突变频率最高，其次是r132c突变。idh2的突变类型包括了r140q、r140l、r140w以及r172k、r172m、r172s、r172g、r172w，其中最主要突变类型为r140q，其次为r172k突变(science,2008,321(5897):1807-1812)。这些idh突变体(midh)丧失了野生型idh的正常生理功能，但却获得一种新的催化功能，能够在nadph的辅助下，将α-kg转化成r(-)-2-羟基戊二酸(2-hg)，造成细胞内2-hg大量聚积(nature,2010,465(7300):966；cancercell,2010,17(3):225-234)。2-hg通常被认为是一种致癌代谢产物。这可能是由于2-hg与α-kg结构类似，使它可以占据α-kg相同的结合口袋，从而竞争性地抑制α-kg依赖性双加氧酶，包括组蛋白去甲基化酶、dna去甲基化酶和脯氨酸羟化酶，导致表观遗传调控异常，造成组蛋白和dna高甲基化，进而诱导抑癌基因沉默、影响细胞的正常分化、促进细胞的增殖，最终促进肿瘤的发生与发展(cancercell,2011,19(1):17-30；nature,2012,483(7390):474-478)。同时，2-hg的过量累积也会导致细胞内缺氧诱导因子hif-1α水平升高，而降低内皮他丁的含量，进而促进肿瘤血管的生成和发展(cancercell,2013,23(3):274-276)。因此，idh突变体已成为抗癌药物研发的新靶点。近年来，多家学术机构和制药公司已陆续报道各自研发的idh1和idh2突变体抑制剂，然而，目前只有几款候选药物进入临床试验(jmedchem,2018,61(20):8981-9003)。其中，由agios公司研发的ag-221和ag-120已先后被美国fda批准上市，分别用于治疗携带idh2和idh1突变的难治性和复发性急性髓性白血病。idh1和idh2突变体抑制剂可以通过降低肿瘤细胞内2-hg水平，逆转组蛋白和dna高甲基化，从而诱导肿瘤细胞分化，发挥抗肿瘤作用。技术实现要素：发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种杂环化合物或其药学上可接受的盐、其制备方法、药物组合物及应用，本发明的化合物具有良好的midh2抑制活性，可以用于制备治疗和/或预防idh2突变所引起的各种相关疾病的药物。技术方案：本发明公开了一种通式i所示的均三嗪类化合物或其药学上可接受的盐：其中：t1和t2独立地选自n或c；当t1为n时，t2选自c；当t1为c时，t2选自c或n；r选自氢、卤素、羟基、胺基、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，所述烷基可任选地被卤素单取代或多取代；y1、y2和y3各自独立地选自氢、c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基或羧基，所述烷基可任选地被下列相同或不相同的取代基单取代或多取代：氢、羟基、c1-c4烷基或羟基c1-c4烷基。进一步地，r选自卤素或c1-c4烷基，所述烷基可任选地被卤素单取代或多取代。更进一步地，r选自氯或三氟甲基。进一步地，y1、y2和y3各自独立地选自氢、羟基甲基、1,2-二羟基乙基、2,3-二羟基丙基或羧基。具体来说，通式i所示的化合物优选自下列化合物i-1到i-14：下面药理实验中涉及的化合物代号等同于此处代号所对应的化合物。本发明还公开了通式i所示化合物的制备方法，包括以下步骤：2-溴-6-三氟甲基吡啶与氰化亚铜发生亲核取代反应制得氰化物1，1在浓盐酸条件下水解生成羧酸2，2与二氯亚砜制成酰氯后与甲醇反应制得甲酯3；3与缩二脲环合制得中间体4；4与三氯氧磷回流制得氯代物5，5与不同取代的胺基吡啶或芳香胺反应制得中间体6；6与脂肪胺(y1y2y3cnh2)反应制得通式(i)化合物，其合成路线如下：其中，r、t1、t2、y1、y2、y3具有通式i中的含义。所述通式i化合物的药学上可接受的盐可通过一般的化学方法合成。一般情况下，盐的制备可以通过游离碱或酸与等化学当量或过量酸(无机酸或有机酸)或碱(无机碱或有机碱)在合适的溶剂或溶剂组合物中反应制得。本发明还提供了一种药物组合物，其由治疗有效量的活性组分和药学上可接受的辅料组成；所述的活性组分包括通式i化合物和其药学上可接受的盐中的一种或多种。所述药物组合物中，所述的辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。根据治疗目的可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液和悬浮液)等，优选片剂、胶囊、液体、悬浮液、和针剂(溶液和悬浮液)。为了使片剂、丸剂或栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋形剂。为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液或悬浮液消毒后(最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油)，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可以使用本领域内任何常用的载体。例如：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、聚乙氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可以加入通常溶解剂和缓冲剂等。本发明所述的组合物在药物组合物中的含量无特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比的5～95％，优选为质量百分比的30～85％。本发明所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据患者年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。本发明另外公开了所述通式i化合物、其药学上可接受的盐或上述药物组合物在制备异柠檬酸脱氢酶2(idh2)突变体抑制剂中的应用。所述的idh2突变体抑制剂用于预防和治疗携带idh2突变的疾病，所述的与idh2突变有关的疾病为癌症。本发明的还公开了具有通式i的化合物、其药学上可接受的盐或所述药物组合物在抗肿瘤方面的应用，其中所述的癌症为恶性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、甲状腺癌、肝癌、食管癌、白血病、胆管癌、软骨肉瘤或血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤中的一种或多种；所述的白血病为急性髓性白血病；所述的胆管癌为肝内胆管癌；所述的脑瘤为原发性胶质瘤或继发性胶质瘤。本发明还公开了具有通式i的化合物、其药学上可接受的盐或所述药物组合物联合一种或多种化疗剂、靶向抗肿瘤药物、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激动剂、抗肿瘤疫苗、抗病毒剂、抗病毒疫苗在制备治疗携带idh2突变的癌症的药物中的应用。所述的化疗剂为烷化剂、微管蛋白抑制剂、拓扑酶抑制剂、铂类药物、抗代谢类药物或激素类抗肿瘤药物；所述的靶向抗肿瘤药物为蛋白激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、异柠檬酸脱氢酶抑制剂、基于表观遗传学的抗肿瘤药物或细胞周期信号通路抑制剂；所述的免疫检查点抑制剂为ctla-4抑制剂、pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、pd-l2抑制剂、tim-3抑制剂、vista抑制剂、lag3抑制剂、tigit抑制剂、a2ar抑制剂或vtcn1抑制剂；所述的免疫检查点激动剂为sting激动剂、4-1bb激动剂、ox40激动剂、rorγ激动剂或icos激动剂。有益效果：本发明提供了一种全新结构的均三嗪类化合物、其药学上可接受的盐、药物组合物、其制备方法，以及它们在制备idh2突变体抑制剂中的用途。本发明通过药理实验结果表明，本发明的化合物对idh2突变体(midh2)活性具有明显的抑制作用，能够有效抑制midh2催化α-酮戊二酸生成2-羟基戊二酸的过程，可以用于制备预防和/或治疗idh2突变所引起的各种相关疾病的药物，其中所述疾病包括携带idh2突变的癌症。具体实施方式为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。其中，实验所用阳性对照药ag-221购自mce公司；所用细胞株均购自atcc。实施例16-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈(1)的制备在干燥的500ml圆底烧瓶中分别加入2-溴-6-(三氟甲基)吡啶(25.0g，110.6mmol)、n,n-二甲基甲酰胺(80ml)、氰化亚铜(14.9g,165.9mmol)和碘化钾(27.5g，165.9mmol)，加热130℃反应12h。冷却，倒入600ml冰水，加入300ml乙酸乙酯，搅拌15分钟，滤去固体，滤液用乙酸乙酯(50ml×12)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得淡黄色液体，直接投入下一步反应。6-(三氟甲基)-吡啶-2-甲酸(2)的制备在干燥的250ml圆底烧瓶中分别加入中间体1和浓盐酸(80ml)，加热80℃反应6h。冷却，加入500ml水稀释，饱和碳酸氢钠溶液调ph至8，乙酸乙酯(50ml×6)将杂质萃取出来，将水相用浓盐酸调ph至5，析出大量白色固体，抽滤，干燥，得白色固体16.5g。1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):13.10(s,1h),7.99-8.17(m,3h).6-(三氟甲基)-吡啶-2-甲酸甲酯(3)的制备在干燥的250ml圆底烧瓶分别加入中间体2(16.5g，86.3mmol)和甲醇(80ml)，搅拌下缓慢滴加二氯亚砜(15.4g，129.5mmol)，滴毕，升至80℃反应12h。冷却，浓缩至干，饱和碳酸氢钠溶液调ph至8，抽滤，干燥，得白色固体16.0g，收率90.4％。1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):8.03-8.18(m,3h),3.80(s,3h).6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1h,3h)-二酮(4)的制备在干燥的500ml圆底烧瓶中分别加入中间体3(16.0g，78.0mmol)、缩二脲(9.6g，93.2mmol)和无水乙醇(80ml)，室温搅拌20min，加入钛酸乙酯(53.4g，234.2mmol)，氮气保护下继续搅拌1h，将钠块(7.2g，313.0mmol)切碎加入80ml无水乙醇中，氮气保护下置于室温使其溶解后加入反应液中，氮气保护下80℃反应72h。冷却，旋蒸浓缩，加入400ml水充分搅拌，用浓盐酸调ph至8，抽滤，水(200ml×4)洗涤，弃去滤饼，合并滤液，用浓盐酸调ph至5，乙酸乙酯(50ml×20)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得淡黄色固体，加入40ml甲醇搅拌20分钟，抽滤，干燥，得白色固体9.0g，收率44.7％。1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):12.32(s,1h),11.50(s,1h),8.48(d,j＝8.7hz,1h),8.35(t,j＝7.5hz,1h),8.19(d,j＝9.0hz,1h).2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(5)的制备向100ml干燥的圆底烧瓶中分别加入中间体4(2g，7.8mmol)和三氯氧磷(20ml)，氮气保护下110℃反应48h。冷却，搅拌下缓慢滴入500ml冰水，二氯甲烷(50ml×12)萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到的红色油状物直接投入下一步反应。4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-n-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(6-1)的制备向100ml干燥的圆底烧瓶中分别加入上一步得到的中间体5、2-三氟甲基-4-氨基吡啶(660mg，4.1mmol)、n,n-二异丙基乙胺(1.1g，8.1mmol)和无水四氢呋喃(40ml)，70℃反应12h。冷却，加入100ml水稀释，乙酸乙酯(50ml×3)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝25：1)，得淡黄色固体0.9g。1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):11.66(s,1h),8.63-8.79(m,3h),8.37(t,j＝7.8hz,1h),8.19(d,j＝6.3hz,1h),7.93(s,1h).2-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,3-丙二醇(i-1)的制备向50ml干燥的圆底烧瓶中分别加入中间体6-1(100mg，0.2mmol)、丝氨醇(50mg，0.5mmol)和四氢呋喃(15ml)，70℃反应12h。冷却，加入100ml水稀释，乙酸乙酯(50ml×3)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得淡黄色固体110mg，收率97.4％，mp199-201℃。es-ms:476.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.67(s,1h),8.54-8.68(m,3h),8.33(t,j＝7.5hz,1h),8.11(d,j＝6.2hz,1h),7.78-8.03(m,2h),4.76(dt,j＝21.2,5.9hz,2h),4.05-4.31(m,1h),3.55-3.69(m,4h).实施例23-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-2)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-1与3-氨基-1,2-丙二醇反应制得淡黄色固体，收率88.5％，mp131-133℃。es-ms:476.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.59(s,1h),8.36-8.60(m,3h),8.23(t,j＝8.6hz,1h),8.12(d,j＝20.7hz,1h),7.98-8.03(m,2h),4.79(dd,j＝23.9,6.2hz,1h),4.57(t,j＝4.5hz,1h),3.64-3.69(m,1h),3.49(dd,j＝11.7,6.5hz,2h),3.33(dd,j＝5.6,2.8hz,2h).实施例3(s)-3-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-3)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-1与(s)-3-氨基-1,2-丙二醇反应制得白色固体，收率88.5％，mp213-215℃。es-ms:476.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.59(s,1h),8.37-8.60(m,3h),8.23(t,j＝9.2hz,1h),8.12(d,j＝21.1hz,1h),7.98-8.04(m,2h),4.74-4.84(dd,j＝23.7,6.0hz,1h),4.56(t,j＝6.1hz,1h),3.64-3.69(m,1h),3.49(dd,j＝14.9,5.8hz,2h),3.33(dd,j＝5.7,3.3hz,2h).实施例4(r)-3-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-4)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-1与(r)-3-氨基-1,2-丙二醇反应制得白色固体，收率88.5％，mp211-213℃。es-ms:476.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.59(s,1h),8.37-8.60(m,3h),8.23(t,j＝9.2hz,1h),8.12(d,j＝21.3hz,1h),7.98-8.03(m,2h),4.79(dd,j＝23.8,6.1hz,1h),4.57(t,j＝6.3hz,1h),3.62-3.72(m,1h),3.49(dd,j＝14.7,6.2hz,2h),3.33(dd,j＝5.9,3.1hz,2h).实施例5(l)-n-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)丝氨酸(i-5)的制备向50ml干燥的圆底烧瓶中分别加入中间体6-1(420mg，1mmol)、(l)-丝氨酸甲酯盐酸盐(330mg，2.1mmol)、三乙胺(320mg，3.1mmol)和四氢呋喃(20ml)，70℃反应12h，加入1mol/l的氢氧化钠溶液(2.5ml)，70℃继续反应12h。冷却，加入100ml水稀释，1mol/l的氢氧化钠溶液调ph至9，乙酸乙酯(50ml×2)将杂质萃取出来，将水相用浓盐酸调ph至5，乙酸乙酯(50ml×3)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得白色固体180mg，收率36.8％，mp207-209℃。es-ms:490.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):12.79(s,1h),10.75(s,1h),8.53-8.62(m,2h),8.29-8.43(m,3h),8.12(dd,j＝6.1,3.1hz,1h),8.02(d,j＝3.4hz,1h),4.62(dd,j＝12.6,3.1hz,1h),4.54(t,j＝3.2hz,1h),3.88(d,j＝2.9hz,2h).实施例6(l)-n-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)丝氨酸钠盐(i-6)的制备向50ml干燥的圆底烧瓶中分别加入化合物i-5(150mg，0.3mmol)、固体氢氧化钠(10mg，0.25mmol)和甲醇(10ml)，室温反应12h。减压浓缩，析出少量白色固体，抽滤，干燥，得白色固体20mg，收率12.8％，mp221-223℃。es-ms:512.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.75(s,1h),8.53-8.62(m,2h),8.29-8.43(m,3h),8.12(dd,j＝5.8,2.9hz,1h),8.02(d,j＝3.1hz,1h),4.62(dd,j＝12.2,3.2hz,1h),4.54(t,j＝3.3hz,1h),3.88(d,j＝3.0hz,2h).实施例74-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-n-(3-(三氟甲基)苯基)-1,3,5-三嗪-2-胺(6-2)的制备参照中间体6-1的合成方法，由中间体5与3-三氟甲基苯胺反应制得白色固体。1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):11.33(s,1h),8.62-8.69(m,2h),8.36(t,j＝8.8hz,1h),8.19(d,j＝9.1hz,1h),7.96(dd,j＝27.2,8.9hz,1h),7.48-7.64(m,1h).2-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,3-丙二醇(i-7)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-2与丝氨醇反应制得白色固体，收率97.4％，mp161-163℃。es-ms:475.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.21(s,1h),8.48-8.65(m,2h),8.30(t,j＝7.5hz,1h),8.05(dd,j＝20.8,8.9hz,2h),7.45-7.73(m,2h),7.34(d,j＝6.2hz,1h),4.72(dt,j＝27.1,6.3hz,2h),4.05-4.26(m,1h),3.61(t,j＝4.5hz,4h).实施例83-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-8)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-2与3-氨基-1,2-丙二醇反应制得白色固体，收率88.5％，mp193-195℃。es-ms:475.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.24(s,1h),8.49-8.66(m,2h),8.30(t,j＝7.5hz,1h),8.05-8.21(m,2h),7.51-7.93(m,2h),7.34(d,j＝9.4hz,1h),4.85(dd,j＝29.6,6.1hz,1h),4.64(dt,j＝21.2,6.3hz,1h),3.70-3.78(m,1h),3.39-3.63(m,4h).实施例9(s)-3-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-9)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-2与(s)-3-氨基-1,2-丙二醇反应制得白色固体，收率88.5％，mp211-213℃。es-ms:475.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.24(s,1h),8.49-8.66(m,2h),8.30(t,j＝7.5hz,1h),8.05-8.21(m,2h),7.51-7.94(m,2h),7.34(d,j＝6.4hz,1h),4.86(dd,j＝30.1,6.2hz,1h),4.64(dt,j＝21.2,6.1hz,1h),3.71-3.78(m,1h),3.39-3.64(m,4h).实施例10(r)-3-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-10)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-2与(r)-3-氨基-1,2-丙二醇反应制得白色固体，收率88.5％，mp207-209℃。es-ms:475.2[m+h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.24(s,1h),8.48-8.66(m,2h),8.30(t,j＝8.9hz,1h),8.05-8.21(m,2h),7.51-7.94(m,2h),7.34(d,j＝6.2hz,1h),4.85(dd,j＝30.1,6.2hz,1h),4.64(dt,j＝20.9,5.9hz,1h),3.70-3.77(m,1h),3.39-3.64(m,4h).实施例114-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-n-(6-氯吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(6-3)的制备参照中间体6-1的合成方法，由中间体5与2-氨基-6-氯吡啶反应制得淡青色固体。1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):11.05(s,1h),8.54(d,j＝9.2hz,1h),8.41(t,j＝7.5hz,1h),8.22(t,j＝6.1hz,2h),7.94(t,j＝7.4hz,1h),7.28(d,j＝9.2hz,1h).2-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((6-氯吡啶-2-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,3-丙二醇(i-11)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-3与丝氨醇反应制得白色固体，收率97.4％，mp221-223℃。es-ms:440.1[m-h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.36(s,1h),8.57-8.62(m,1h),8.28-8.39(m,2h),8.10(d,j＝8.9hz,1h),7.63-7.92(m,2h),7.12-7.16(m,1h),4.74(dt,j＝24.2,6.1hz,2h),4.03-4.23(m,1h),3.51-3.64(m,4h).实施例123-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((6-氯吡啶-2-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-12)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-3与3-氨基-1,2-丙二醇反应制得淡黄色固体，收率97.4％，mp111-113℃。es-ms:440.1[m-h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.38(s,1h),8.41-8.61(m,2h),8.06-8.29(m,3h),7.77-7.91(m,1h),δ7.12(d,j＝9.3hz,1h),4.63-4.93(m,2h),3.26-3.72(m,5h).实施例13(s)-3-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((6-氯吡啶-2-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-13)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-3与(s)-3-氨基-1,2-丙二醇反应制得淡黄色固体，收率97.4％，mp181-183℃。es-ms:440.1[m-h]+；1hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):10.38(s,1h),8.42-8.62(m,2h),8.06-8.31(m,3h),7.77-7.91(m,1h),7.13(d,j＝9.1hz,1h),4.63-4.92(m,2h),3.23-3.73(m,5h).实施例14(r)-3-((4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((6-氯吡啶-2-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基-1,2-丙二醇(i-14)的制备参照i-1的合成方法，由中间体6-3与(r)-3-氨基-1,2-丙二醇反应制得淡黄色固体，收率97.4％，mp179-181℃。es-ms:440.1[m-h]+；1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ(ppm):10.39(s,1h),8.42-8.62(m,2h),8.06-8.31(m，3h),7.77-7.93(m,1h),7.12(dd,j＝9.1,3.1hz,1h),4.89(dd,j＝33.1,6.2hz,1h),4.69(dt,j＝18.1,6.0hz,1h),3.22-3.78(m,5h).实施例15药理实验1：化合物对idh2r140q的抑制活性测定idh2r140q突变体可以催化α-kg转化为2-hg，同时将nadph氧化为nadp+，因此可以通过检测nadph的消耗值来评价本发明化合物对idh2r140q突变体的抑制活性。阳性药为ag-221。实验方法：在96孔板中加入含25mmtris(ph7.4)，150mmnacl，10mmmgcl2，0.03％bsa的反应缓冲液，再加入浓度梯度的化合物，以及酶反应的底物1mmα-kg和100μmnadph，最后加入浓度为0.5μg/ml的idh2r140q，总体积为200μl。使用thermo酶标仪在室温下在340nm波长下连续检测nadph的吸光值变化。根据nadph的消耗计算孵育不同时间点时化合物对idh2r140q的抑制率，并通过graphpadprism5软件计算ic50值。试验数据见表1。药理实验2：化合物对idh2wt的抑制活性测定野生型idh2在nadp+辅助作用下，催化异柠檬酸生成α-kg，并伴有nadph的生成。因此可以通过检测nadph的增加值来检测化合物对野生型idh2的抑制活性。阳性药为ag-221。实验方法：在96孔板中加入含50mmtris(ph7.4)，5mmmgcl2，0.03％bsa的反应缓冲液，再加入浓度梯度的化合物，以及酶反应的底物200μmict和200μmnadp，最后加入浓度为0.3μg/ml的idh2，总体积为200μl。使用thermo酶标仪在室温下在340nm波长下连续检测nadph的吸光值变化。根据nadph的增加值来计算孵育不同时间点时化合物对idh2活性的抑制，并通过graphpadprism5软件计算ic50值。实验结果见表1。表1中化合物ic50值的区间范围：a代表1～300nm，b代表300～1000nm，c代表1000nm以上。表1本发明化合物对idh2的抑制活性和选择性实验结果表明，本发明的化合物在极低浓度下即可有效抑制idh2r140q突的活性。其中i-7、i-8、i-9和i-10的ic50明显优于阳性对照药ag-221，尤其是i-10对idh2r140q的抑制活性比ag-221提高58倍。更为难得的是，本发明的化合物对野生型idh2的活性抑制作用弱，显示出极高的选择性，而且显著优于阳性药ag-221。药理实验3：化合物对idh2r140q突变的tf-1细胞2-hg抑制活性测定使用携带idh2r140q突变的tf-1细胞进行评价化合物对肿瘤细胞内2-hg的抑制活性。tf-1_idh2r140q细胞购自atcc。细胞内2-hg的含量使用lc-ms/ms进行检测。阳性对照药为ag-221。实验方法：tf-1_idh2r140q细胞以5×104/ml密度接种于12孔板内，与待测化合物浓度梯度孵育72小时，收集细胞。将细胞沉淀物悬浮于100μl的80％甲醇水溶液中，13000rpm离心10min在4℃环境下除去沉淀，储存于-80℃冰箱。进样前，再次13000rmp离心10min，转移上清液(约100μl)至液相内插管内，待进样。标准品采用d-2-羟基戊二酸二钠盐(sigma-aldrich#h8378)，浓度设为13.6ng/ml,68ng/ml,340ng/ml,1.70μg/ml,8.48μg/ml,42.4μg/ml。测试仪器为qexactivetmplus-orbitraptmms,thermoscientific台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪。色谱柱为watertmacquitytmuplchss-t3-1.8μm,21mm×100mm,partno186003539，流动相为甲酸水溶液(色谱纯)；phaseb：乙腈(色谱纯)。洗脱条件见表2：表2.lc-ms洗脱条件timeflow[ml/min]％b0.000run0.0000.2001％1.5000.2001％2.0000.20070％3.5000.20070％3.6000.2001％5.0000.2001％5.000stoprun通过graphpadprism5软件计算ic50值。本发明部分化合物对tf-1_idh2r140q细胞内2-hg水平的抑制活性见表3。表3本发明化合物对tf-1_idh2r140q细胞2-hg的抑制活性化合物编号ic50(nm)ag-22125.0i-770.6i-9198.6i-1013.2实验结果表明，本发明化合物在nm浓度下可有效抑制tf-1_idh2r140q细胞的2-hg水平，化合物i-10的活性明显优于阳性药ag-221。药理实验4：化合物体外肝微粒体代谢稳定性测试采用肝微粒体实验评价本发明部分化合物的体外代谢稳定性。代谢稳定性通过底物消除法分析化合物的剩余底物浓度水平随时间的变化，计算体外消除半衰期(t1/2)。实验材料：名称供应商货号批号人肝微粒体ivtx008070iqf小鼠肝微粒体xenotechm10001610148受试化合物与人源性和鼠源性肝微粒体孵育，体系总体积为100μl。加入10μl化合物(终浓度1μμ)，50μl肝微粒体(终浓度0.5mg/ml)，40μlnadph反应体系。恒温振荡水浴(37℃)中温孵，分别于0、5、10、20、30、60min时，加入300μl终止液(终浓度为100ng/ml甲苯磺丁脲的乙腈溶液)，终止反应。在整个实验过程中保持试管开放，以保证氧的参与。终止反应后样品于13000×g离心10min(4℃)，取上清液5μl，进行lc-ms/ms分析化合物的剩余量，平行实验3次，考察化合物的代谢稳定性。具体试验数据见表4。表4本发明化合物体外肝微粒体酶代谢稳定性试验数据实验结果显示，本发明的化合物i-10显示出优异的体外代谢稳定性，显著优于3个阳性对照药。药理实验5：化合物对idh2r140q突变的tf-1细胞增殖和分化的影响不同tf-1细胞株对gm-csf的依赖作用：tf-1细胞系依赖gm-csf进行增殖。首先将tf-1_idh2wt、tf-1_idh2r140q细胞在完整培养基中培养，在测定增殖能力之前去除培养基中的gm-csf，培养3天，用mtt法检tf-1_idh2wt和tf-1_idh2r140q的增殖能力，判断转染细胞株对gm-csf的依赖性变化。化合物对细胞增殖的影响：将tf-1_idh2wt和tf-1_idh2r140q细胞分别与一定浓度的化合物共孵育7天，mtt法测定化合物存在和不存在时两种细胞增殖能力的变化。化合物对细胞分化的影响：将tf-1_idh2wt和tf-1_idh2r140q细胞分别与一定浓度的化合物共孵育7天，去掉培养基中的gm-csf，加入促红细胞生成素(epo)诱导细胞分化7天，离心收集细胞，pbs清洗，观察并拍照细胞血红素生成的颜色变化作为细胞分化的指标。测试结果表明，受试化合物i-10在1μm浓度下能显著抑制gm-csf非依赖的tf-1_idh2r140q细胞的增殖，并且能明显诱导tf-1_idh2r140q细胞的重新分化。采用相同的方法，本发明还检测了化合物i-10对其它携带idh2r140q突变的肿瘤细胞株的增殖抑制活性，其中包括结肠癌hct116细胞和恶性胶质瘤u87细胞。结果表明，化合物i-10对hct116_idh2r140q和u87_idh2r140q细胞增殖均具有抑制作用。药理实验6：tf-1_idh2r140q突变细胞皮下移植瘤体内药效评价化合物i-10的体内2-hg抑制活性评价使用含tf-1_idh2r140q突变细胞皮下移植瘤的ncg小鼠进行。ncg小鼠购于南京大学动物模式研究所。扩增tf-1_idh2r140q细胞，将对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤接种。按照5×106细胞量/小鼠分别接种至经过亚致死剂量辐照的ncg小鼠身体右侧腰背部皮下，并每天两次腹腔给予人gm-csf，待肿瘤体积达到200mm3时进行分组，并持续给予人gm-csf。无突变对照组使用tf-1细胞株接种，化合物和溶媒(2％无水乙醇：10％solutol：88％生理盐水(v/v/v))对照组使用tf-1_idh2r140q接种。各组分别灌胃给予相应浓度的化合物溶液，给药体积为100μl/10g体重，对照组给予相同体积的空白溶媒。给药10天后处死小鼠，剥离肿瘤，匀浆，检测瘤内的2-hg含量。lc-ms/ms分析条件参见实例17实验方法部分。经lc-ms/ms测得每组中各只动物肿瘤匀浆液2-hg浓度计算百分比(2-hg％)。受试化合物给药后小鼠肿瘤内2-hg的相对百分含量(均值)如表5所示。结果表明，化合物i-10对tf-1_idh2r140q细胞皮下移植瘤内2-hg的抑制活性强于ag-221。表5给药10天后瘤内2-hg％组别剂量(mg/kg)2-hg％tf-1对照组-0tf-1_idh2r140q对照组-100ag-2217.550.3ag-221159.7ag-22130-4.6i-107.560.5i-10155.2i-1030-8.6当前第1页12