一种具有促进化妆品中SOD活性的噻二唑类分子及其制备方法和应用与流程

本发明属于蛋白酶激动剂合成技术领域，具体涉及一种具有促进化妆品中sod活性的噻二唑类分子及其制备方法和应用。

背景技术：

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)是一种含铜、锌、铁和锰的金属蛋白酶，广泛存在于动物、植物、微生物中，具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内氧自由基的功能，是消除皮损及清除超氧离子自由基的一种非常好的抗氧化酶，是生物体有效清除活性氧的重要酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线，具有抗衰老、抗氧化、防晒等重要作用。随着预防衰老的医药品开发的活跃，化妆品市场也呈现出新的动向，最引人注目的是生物制品在化妆品中的渗透和应用，目前预防皮肤衰老、祛斑防皱以及防晒的产品开发是化妆品工业中最受关注及最热门的课题。

sod有多种抗氧化酶成分，它通过歧化反应可以有效阻止或减少对机体有害超氧阴离子自由基的反应。自由基是由具有不配对价电子的原子或原子团，分子或离子构成的。在正常生理状况下，生物体内将不断地产生自由基，自由基的产生与清除处于平衡状态。但是在某些病理情况下，自由基产生量多时，机体就会产生疾病。由于自由基具有高度的化学活性，是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，自由基攻击生物大分子导致组织损伤是许多疾病发生发展的根源。故sod在防御生物体免受超氧阴离子自由基损伤方面有重要作用。

sod既可作为药用酶，也可作为化妆品的添加剂。因其具有明显的防晒效果，可有效防止皮肤受紫外线的辐射，减少氧自由基的损害，有明显的抗炎效果，对皮肤病有一定的改善作用，所以sod的一个重要应用就是可以作为化妆品的添加剂。国际生化委员会，美国联邦食品管理局称其为“抗衰因子”、“美容娇子”。国内外许多化妆品厂家都在自身产品中加入了一定比例的sod。如法国的雅诗兰黛石榴水、日本的skii神仙水，以及国内大宝sod蜜、百雀羚系列的护肤品等。

由于sod作为一种蛋白，当加入化妆品中时，收到化妆品中各种化合物的直接作用及周围环境ph的影响，其活性会显著降低，因此目前很多科研机构正在通过各种方式来进行稳定或提高sod的活性的研究，比如发明专利：一种新型重组高稳定性超氧化物歧化酶及其应用(cn105624126a)；一种低温超氧化物歧化酶保护剂及其制备方法(cn107083380a)。我公司通过化学手段合成了一种噻二唑类化合物分子，最后经活性测试，发现能够提高sod的活性，因而其是一种良好的sod激动剂。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种结构新颖，并且可用于促进化妆品中sod活性的噻二唑类分子及其制备方法和应用。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种具有促进化妆品中sod活性的噻二唑类分子，其特征在于具有如下结构：

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种具有促进化妆品中sod活性的噻二唑类分子的制备方法，其特征在于具体步骤为：

(1)、把甲酰胺和氨基硫脲加入到二甲基亚砜中，再加入蒙脱石颗粒；缓慢升温至90℃，反应结束后趁热过滤反应液，然后把反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，浓缩后再加入甲醇重结晶得到胺甲醛缩基脲；所诉的氨基硫脲与蒙脱石颗粒的投料量质量比为1:0.2；所诉的氨基硫脲与甲酰胺的投料量摩尔比为1:2；

(2)、把胺甲醛缩基脲加入无水乙腈，于0℃向混合液中加入碳酸钾，再加入二碳酸二叔丁酯，滴加完后缓慢恢复至室温，搅拌一段时间后进行抽滤，水洗反应液，然后再用乙酸乙酯萃取反应液多次，滤液浓缩得到boc-胺甲醛缩基脲；

(3)、把boc-胺甲醛缩基脲和三乙胺加入吡啶中，再加入异硫氰酸苯酯，滴加完后继续升温至回流，反应结束后把反应液倒入水中，再用二氯甲烷萃取反应液多次，合并有机相，浓缩得到n-苯基-boc-胺甲醛缩基双硫脲；所诉boc-胺甲醛缩基脲与三乙胺与异硫氰酸苯酯的投料量摩尔比为1:1.5:1；

(4)、在密闭反应瓶中，把n-苯基-boc-胺甲醛缩基双硫和过氧乙酸加入3％的双氧水，滴加完后继续升温至回流，反应结束后趁热过滤反应液，真空整除反应溶液，将浓缩物加入到水和甲醇的混合溶液中，加热至回流，然后缓慢降至室温，降温过程中有大量固体析出，抽滤得到n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺；所诉的n-苯基-boc-胺甲醛缩基双硫与过氧乙酸的投料量摩尔比为1:0.5～1；

(5)、把n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺加入到二氯甲烷搅拌均匀，再加入一定量的环合催化剂，加完后升温至回流，反应结束后过滤反应液，然后再加入一定量的三氟乙酸，继续加热至回流，反应一段时间后加入水，用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液ph为中性，分出有机相，浓缩得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺；所说的环合催化剂为聚苯乙烯碳酸钙复合物(m聚苯乙烯：m碳酸钙＝5:1)或聚四氟乙烯碳酸钙复合物(m聚四氟乙烯：m碳酸钙＝5:1)；所诉的n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺与环合催化剂的投料量质量比为10:1～2；

(6)、把5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺加入氯仿中，再加入浓盐酸，反应温度至于-5℃，快速加入亚硝酸钠，继续搅拌均匀后保持温度不变，再滴加溶有三氯化磷的氯仿溶液，滴加完后缓慢升温至室温，原料反应完全后加入水淬灭反应，分离有机相，水相经氯仿洗涤多次，合并有机相，浓缩有机相得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-氯；所诉的5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺与亚硝酸钠与三氯化磷的投料量摩尔比为1:3:2；

(7)、把5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-氯和硫代乙酸钾加入n,n-二甲基甲酰胺中，加热至100℃，反应结束后加入到水中淬灭，水相经二氯甲烷洗涤多次，合并有机相，浓缩有机相得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫代乙酸酯；所诉的5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-氯与硫代乙酸钾的投料量摩尔比为1:2；

(8)、把5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫代乙酸酯加入到氨水中，升温至回流℃，反应至tlc检测原料无剩余后，浓缩得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫醇；

(9)、将对甲氧基苯胺加入乙酸乙酯中，在0℃条件缓慢滴加氯乙酰氯，滴加完后搅拌，水洗反应液，分出有机相，浓缩后加入n,n-二甲基甲酰胺中，再加入5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫醇和无水氢氧化钡，在80℃加热反应至原料反应完全，过滤反应液，再加入二氯甲烷萃取反应液三次，合并有机相后用水洗涤后浓缩，然后在乙腈中加热回流再冷却重结晶得到目标化合物；所诉的对甲氧基苯胺与氯乙酰氯与5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫醇与无水氢氧化钡的投料量摩尔比为1:1.2:1:1。

附图说明

图1噻二唑类分子的核磁氢谱

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

在反应瓶中，把甲酰胺9g和氨基硫脲9g加入到二甲基亚砜50ml中，再加入蒙脱石颗粒1.8g；缓慢升温至90℃，反应至tlc显示原料消失，趁热过滤反应液，然后把反应液倒入水100ml中，用二氯甲烷50ml萃取多次，合并有机相，浓缩后再加入甲醇50ml，缓慢升温至60℃后缓慢降温至0℃，降温过程中有大量固体析出，抽滤得到胺甲醛缩基脲10g；anal.calcdforc2h6n4s:c,20.33；h,5.12；n,47.42.found:c,20.57；h,5.03；n,47.19.

实施例2

在多口瓶中加入胺甲醛缩基脲12g和无水乙腈100ml，于0℃向混合液中加入碳酸钾40g，逐滴滴加二碳酸二叔丁酯32g，滴加完后缓慢恢复至室温，搅拌10h后进行抽滤，水洗反应液，然后再用乙酸乙酯50ml萃取反应液多次，合并有机相浓缩得到boc-胺甲醛缩基脲17g；anal.calcdforc7h14n4o2s:c,38.52；h,6.46；n,25.67.found:c,38.32；h,6.35；n,25.81.

实施例3

在反应瓶中，把boc-胺甲醛缩基脲22g和三乙胺15g加入吡啶200ml中，再加入异硫氰酸苯酯14g，滴加完后继续升温至回流，tlc监控原料反应完全后，把反应液倒入水中，再用二氯甲烷70ml萃取反应液多次，合并有机相，浓缩得到n-苯基-boc-胺甲醛缩基双硫脲33g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.67(s,1h),8.21(s,1h),7.82(d,j＝8.0hz,2h),7.69(d,j＝8.0hz,2h),7.24-7.21(m,1h),7.07-7.03(m,2h),4.71(s,1h),1.52(s,9h).hr-ms(esi⁺)m/z：354.4614[m+h]⁺；anal.calcdforc14h19n5o2s2:c,47.57；h,5.42；n,19.81.found:c,47.28；h,5.36；n,19.61.

实施例4

在密闭反应瓶中，把n-苯基-boc-胺甲醛缩基双硫脲36g和过氧乙酸7.6g加入3％的双氧水500ml，滴加完后继续升温至回流，tlc监控原料反应完全后，趁热过滤反应液，真空整除反应溶液，将浓缩物加入到水100ml和甲醇200ml的混合溶液中，加热至回流，然后缓慢降至室温，降温过程中有大量固体析出，抽滤得到n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺29g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.39(s,1h),8.03(s,1h),7.52-7.47(m,2h),7.37(d,j＝8.0hz,2h),7.06(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h),6.65(s,1h),4.33(s,1h),1.58(s,9h).hr-ms(esi⁺)m/z：335.4017[m+h]⁺

实施例5

在密闭反应瓶中，把n-苯基-boc-胺甲醛缩基双硫脲36g和过氧乙酸3.8g加入3％的双氧水500ml，滴加完后继续升温至回流，tlc监控原料反应完全后，趁热过滤反应液，真空整除反应溶液，将浓缩物加入到水100ml和甲醇200ml的混合溶液中，加热至回流，然后缓慢降至室温，降温过程中有大量固体析出，抽滤经硅胶柱层析分离得到n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺14g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.39(s,1h),8.03(s,1h),7.52-7.47(m,2h),7.37(d,j＝8.0hz,2h),7.06(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h),6.65(s,1h),4.33(s,1h),1.58(s,9h).hr-ms(esi⁺)m/z：335.4017[m+h]⁺

实施例6

在四口瓶中，把n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺33g加入到二氯甲烷300ml，再加入聚苯乙烯碳酸钙复合物(m聚苯乙烯：m碳酸钙＝5:1)5g，加完后升温至回流反应1h，tlc检测反应，原料无剩余后，过滤反应液，然后再加入三氟乙酸11g，继续加热至回流，反应1h后，加入水100ml，用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液ph为中性，分出有机相，浓缩得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺20g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.82(s,1h),7.51(dd,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,2h),7.34(t,j1＝8.0hz,j2＝4.0hz,2h),7.01(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h),6.76(s,2h).hr-ms(esi⁺)m/z：233.2724[m+h]⁺。

实施例7

在四口瓶中，把n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺33g加入到二氯甲烷300ml，再加入聚苯乙烯碳酸钙复合物(m聚苯乙烯：m碳酸钙＝5:1)3.3g，加完后升温至回流反应1h，tlc检测反应，原料无剩余后，过滤反应液，然后再加入三氟乙酸11g，继续加热至回流，反应1h后，加入水100ml，用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液ph为中性，分出有机相，浓缩后经硅胶柱层析分离得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺7g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.82(s,1h),7.51(dd,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,2h),7.34(t,j1＝8.0hz,j2＝4.0hz,2h),7.01(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h),6.76(s,2h).hr-ms(esi⁺)m/z：233.2724[m+h]⁺。

实施例8

在四口瓶中，把n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺33g加入到二氯甲烷300ml，再加入聚苯乙烯碳酸钙复合物(m聚苯乙烯：m碳酸钙＝5:1)6.6g，加完后升温至回流反应1h，tlc检测反应，原料无剩余后，过滤反应液，然后再加入三氟乙酸11g，继续加热至回流，反应1h后，加入水100ml，用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液ph为中性，分出有机相，浓缩得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺16g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.82(s,1h),7.51(dd,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,2h),7.34(t,j1＝8.0hz,j2＝4.0hz,2h),7.01(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h),6.76(s,2h).hr-ms(esi⁺)m/z：233.2724[m+h]⁺。

实施例9

在四口瓶中，把n-2-苯基-n-5-boc-氨甲基腙-1.3.4-噻二唑-2,5-二胺33g加入到二氯甲烷300ml，再加入聚四氟乙烯碳酸钙复合物(m聚四氟乙烯：m碳酸钙＝5:1)5g，加完后升温至回流反应1h，tlc检测反应，原料无剩余后，过滤反应液，然后再加入三氟乙酸11g，继续加热至回流，反应1h后，加入水100ml，用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液ph为中性，分出有机相，浓缩后经硅胶柱层析分离得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺14g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.82(s,1h),7.51(dd,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,2h),7.34(t,j1＝8.0hz,j2＝4.0hz,2h),7.01(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h),6.76(s,2h).hr-ms(esi⁺)m/z：233.2724[m+h]⁺。

实施例10

在反应瓶中，把5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-胺23g加入氯仿200ml中，再加入浓盐酸50ml，反应温度至于-5℃，快速加入亚硝酸钠20g，继续搅拌10min，保持温度不变，再滴加溶有三氯化磷28g的氯仿溶液150ml，滴加完后继续搅拌30min，缓慢升温至室温，tlc监控原料反应完全后，加入水200ml淬灭反应，分离有机相，水相经氯仿洗涤多次，合并有机相，浓缩有机相经硅胶柱层析分离得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-氯20g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.76(s,1h),7.53(dd,j1＝4.0hz,j2＝8.0hz,2h),7.36(t,j1＝4.0hz,j2＝4.0hz,2h),7.02(t,j1＝8.0hz,j2＝8.0hz,1h).hr-ms(esi⁺)m/z：252.7078[m+h]⁺。

实施例11

在反应瓶中，把5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-氯25g和硫代乙酸钾23g加入n,n-二甲基甲酰胺200ml中，加热至100℃，反应5h后加入到水500ml中，水相经二氯甲烷100ml洗涤多次，合并有机相，浓缩有机相得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫代乙酸酯26g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.65(s,1h),7.65-7.61(m,2h),7.27(t,j1＝8.0hz,j2＝4.0hz,2h),6.98-6.95(m,1h),2.71(s,3h).hr-ms(esi⁺)m/z：292.3576[m+h]⁺。

实施例12

在四口瓶中，把5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫代乙酸酯29g加入到含量为25％的氨水300ml，升温至回流℃，反应至tlc检测原料无剩余后，浓缩得到5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫醇17g；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ12.92(s,1h),8.39(s,1h),7.69(d,j＝8.0hz,2h),7.45(t,j1＝8.0hz,j2＝4.0hz,2h),7.06-7.03(m,1h).hr-ms(esi⁺)m/z：250.2315[m+h]⁺。

实施例13

在反应瓶中，将间乙酮基苯胺14g加入乙酸乙酯80ml中，在0℃条件缓慢滴加氯乙酰氯13.5g，滴加完后搅拌30min，水洗反应液，分出有机相，浓缩后加入n,n-二甲基甲酰胺150ml中，再加入5-(苯基胺基)噻唑[2,3-c]并[1,2,4]-三氮唑-3-硫醇25g和无水氢氧化钡17g，在80℃加热反应1h，tlc监控原料反应完全，过滤反应液，再加入二氯甲烷200ml萃取反应液三次，合并有机相后用水200ml洗涤后浓缩，然后在乙腈100ml中加热回流再冷却重结晶得到目标化合物35g；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ10.39(s,1h),8.13(s,1h),7.81(d,j＝8.0hz,1h),7.63-7.53(m,6h),7.35(t,j1＝12.0hz,j2＝8.0hz,1h),7.12(s,1h),4.02(s,2h),2.51(s,3h).hr-ms(esi⁺)m/z：423.5018[m+h]⁺；anal.calcdforc19h16n6o2s2:c,53.76；h,3.80；n,19.80.found:c,53.97；h,3.59；n,19.62。

实施例14

sod酶活测试

通过碧云天的总sod活性检测试剂盒(nbt法)进行比色来检测化妆品中sod的活性。该方法采用经典的氮蓝四唑(nbt)显色法。通过黄嘌呤(xanthine)及黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)反应系统产生超氧阴离子(o2^-)，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物歧化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。

样品准备：取新鲜的具有活性的大宝sod蜜1g(活性需大于200u/mg)，溶于dmso20ml中，搅拌均匀后至于室温条件下待用；把得到的嘧啶酮类分子溶于dmso中，配置成浓度为1g/l，2g/l，4g/l，8g/l，16g/l，32g/l，64g/l的七个梯度的样品各10ml。

试剂盒准备：nbt工作液的配制：按照每1.8mlsod检测缓冲液中加入50μlnbt的比例进行配制(用sod检测缓冲液将nbt稀释约36倍)，混匀后即为nbt工作液。

酶工作液的配制：先把试剂盒中的酶溶液轻轻混匀，并轻轻离心沉淀酶溶液至管底。按照每200μl稀释液中加入5μl酶溶液的比例进行配制(用稀释液将酶溶液稀释约40倍)，混匀后即为酶工作液。

在96孔板中，先加入sod蜜样品液40μl，再分别加入嘧啶酮类分子溶液20μl，最后加入酶工作液30μl；37℃孵育20分钟；在560nm测定吸光度(od值)；未加嘧啶酮类分子溶液，只加入dmso作为空白对照。

酶活百分比＝[(od空白对照-od样品)/od空白对照]×100％

由上表可以看出，随着目标化合物浓度的提高，对sod酶的激动作用逐渐升高，当浓度达到64g/l时，酶活达到34.8％。

实施例15

人体皮肤斑贴实验

我们对浓度分别为8g/l和16g/l的目标化合物进行试验，阴性对照为空白对照。受试者者共30人，均为女性，年龄为20～40；选用合适的斑试器，将目标化合物1ml涂于其中，外用胶带贴敷于受试者背部，24h去除受试物，分别于斑贴试验0.5、24、48h观察皮肤反应，根据《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。本试验结果显示浓度为8g/l时30人中2例2级反应，根据《化妆品卫生规范》中规定，该受试物对人体皮肤未引起不良反应；浓度为16g/l时30人中5例2级反应，根据《化妆品卫生规范》中规定，该受试物对人体皮肤引起不良反应；由此可见该化合物添加浓度不能超过8g/l。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。