一种高活性生物农药微囊缓释剂的制备方法及应用与流程

本发明属于农作物病害防治领域，具体涉及一种高活性生物农药微囊缓释剂的制备方法及应用。

背景技术：

我国是一个农业大国，在农业生产中每年需要大量的农药来防治农作物的病害和虫害。化学农药具有防效高、速度快、杀虫抗菌谱广、成本低、使用简单等优点，因此得到广泛应用。但是化学农药的长期、大量和反复使用，给土壤、水体和大气带来了严重的污染，农副产品中农药残留的检出率高达90%上，也给人类的健康及生存带来了极大的隐患。此外，新农药的开发周期长、成本高，防治目标抗药性逐渐增强以及生物技术快速发展带来的冲击，使当今化学农药行业正面临严峻的挑战。因此，要想使农药产业向着健康的方向发展，就必须加快研究出高效、安全的新型农药，走可持续发展的农业病害防治之路。

生物农药是指利用生物体内的活性物质和它们所产生的代谢物而制成的可以用来防控病虫草等有害生物的一类农药制剂，与化学农药相比，生物农药具有以下优点：1）生产原料来源广泛，研发、利用途径多；2）毒性低、易降解，对环境安全；3）选择性强，不会对非靶标生物造成伤害；4）防治目标不易产生抗药性。生物农药的分类方式有多种，按有效成分来源可分为微生物源农药、植物源农药、动物源农药以及转基因植物等；按作用靶标的类别可分为生物杀虫剂、生物杀菌剂、生物除草剂和生物生长调节剂等；按起作用的物质又可分为活体生物农药和代谢产物生物农药。目前大量研究及应用的是微生物源农药，它在生物农药中占据着最大的比例，主要包括细菌类微生物农药、真菌类微生物农药、病毒类微生物农药和农用抗生素等。已经开发成的产品主要有苏云金杆菌、白僵菌、绿僵菌、赤僵菌、木霉菌、井冈霉素、赤霉素、阿维菌素、春雷霉素等。生物农药因具有高效、广谱、对人畜安全及与生态环境相容等特点，符合目前我国农业和环境可持续发展的要求。随着人类环保意识的增强和对“无公害产品”需求的增加，生物农药具有广阔的前景和强大市场竞争力，在农药中所占比重将越来越大，必将成为21世纪农药发展的热点之一。

大豆菌核病又称白腐病，是由核盘菌（sclerotiniasclerotiorum）引起的重要病害，在大豆种植到七月下旬开始发病，主要为害地上部，苗期、成株均可发病，花期受害重，产生苗枯、叶腐、茎腐、荚腐等症。大豆菌核病在全国各地均可发生，流行年份发病率为20-30%，严重时发病率达到50%以上，导致大豆局部或全株枯死，百粒重严重下降，造成减产甚至绝产。目前，对菌核病的化学防治多采用速克灵、甲基硫菌灵、多菌灵、菌核净等几种化学农药，这些药剂的常年使用容易造成环境污染、抗药性增加、防效降低和防治成本增加。鉴于上述原因，20世纪80年代以来人们逐渐把目光投向了生物防治。

芽孢杆菌是广泛存在于土壤和自然界中的一类好氧型菌，其菌体代谢活力强，在条件改变、菌体存活受到抑制时能产生芽孢进行自我保护。由于其大多数无毒、对人畜无害、能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶、多肽或脂类等活性物质，且具有繁殖速度快、抗逆性强、易定植于植物根际等优点，成为目前研究最多的植物促生细菌与植物病害生防细菌。微生物源生物农药的绝大部分产品都是以活菌为有效成分的，产品中必须含有相当数量的活菌数才能达到作用的效果，因此活菌数是衡量微生物源农药品质的重要指标。对于芽孢杆菌来说，活菌数与芽孢率是影响芽孢杆菌农药制剂生防效果的关键因素，并且芽孢体和活菌体相比具有抗逆性强、耐酸、耐碱、耐热的优势，在现代化生产过程中可以较好的保存菌体的活性，便于加工、储存、运输，因此通过先进的发酵技术来提高活菌数与芽孢率是近年来研究的热点。

当前国内登记生产的微生物源农药的制剂类型主要是可湿性粉剂，还有少量水剂、悬浮剂和水分散粒剂。这些剂型在常温储存时易失活，产品货架期短，因此限制了生物农药的产业化发展。此外可湿性粉剂还存在着粉尘飞扬，易污染环境的缺点。微囊化是指利用物理、化学及物理化学或生物学的方法将化学物质或生物材料包覆在囊壁材料中，并控制释放。与以上传统农药剂型相比，微囊剂具有如下的特点：（1）可以将微生物与外界环境隔绝，因此受环境（光、空气等）影响较小，稳定性好，活性高；（2）可以控制微生物释放到外界环境的速率，达到缓释控释的效果；（4）以水为溶剂，降低环境污染。因此将芽孢杆菌作为活性成分制备成微囊化生物农药也是本发明的重点研究目的。

技术实现要素：

针对现有技术存在的芽孢杆菌发酵生产过程中菌体数和芽孢率较低，微生物源农药稳定性不高，货架期短，微生物容易死亡失活，导致防治效果变差的问题，提供一种高活性生物农药微囊缓释剂的制备方法及应用。

为解决上述问题，本发明采用如下所述的技术方案：

一种高活性生物农药微囊缓释剂的制备方法及应用，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1）菌种活化：无菌条件下分别将环蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的保藏菌种转接至lb斜面培养基，置于30℃恒温培养12h，如此转接3次使菌种恢复活性；

2）种子液的制备：取活化后的蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，分别以2%的接种量接入种子培养基中进行摇瓶培养24h，在培养过程中对种子液间歇性施加低频电磁场辐射；摇瓶培养的条件为：装液量100ml/500ml，培养温度30℃，摇床转速180rpm；

3）分段补料发酵培养：以5%的总接种量将蜡状芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中，培养基ph调节为7.0-7.4，装液量为发酵罐体积的40-50%，发酵温度为34-36℃，通气量为1.1-1.3vvm，转速为220-260rpm，在芽孢杆菌生长进入对数期时，每隔8h补加1次补料培养基1，一共补加3次，在芽孢杆菌生长进入稳定期时，补加1次补料培养基2，总发酵时间为38-40h；

4）微囊芯的制备：发酵结束后，取发酵液在4℃和4000r/min的条件下离心15min，除去上清液后将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤2-3次，然后重悬于1.5%海藻糖溶液中，制成微囊芯；

5）微囊缓释剂的制备：称取β-环糊精溶于适量蒸馏水中，在50℃下水浴加热，磁力搅拌一段时间，直至完全溶解形成饱和水溶液作为微囊壁材料，将制备好的微囊芯以1:8（v/v）的比例加入上述微囊壁材料中，再置于超声波振荡器中进行辅助包覆处理，处理结束后待混合溶液冷却至室温再进行减压抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后置于40℃下真空干燥24h，即得生物农药微囊缓释剂。

所述步骤2）中，种子培养基的成分为牛肉膏5g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖5g/l，nacl5g/l，k2hpo41.5g/l，ph调节为7.0。

所述步骤2）中，间歇性施加是指每隔3h施加低频电磁场辐射1h，低频电磁场的参数为频率60hz，电场强度1000v/m，磁场强度0.3mt。

所述步骤3）中，蜡状芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌种子液的接种比例为2:3。

所述步骤3）中，发酵培养基的成分为糖蜜8-10g/l，玉米淀粉5-7g/l，酵母浸粉5.0-6.0g/l，豆粕粉5.9-6.5g/l，k2hpo41.2-1.3g/l，kh2po40.31-0.35g/l，mnso4·h2o0.40-0.46g/l，nacl4.8-5.2g/l，mgso4·7h2o0.66-0.70g/l，cacl20.19-0.23g/l，聚乙烯醇1.7-1.9g/l。

所述步骤3）中，对数期的时间为发酵培养的第7h至第30h，稳定期的时间为发酵培养的第30h后。

所述步骤3）中，补料培养基1的成分为糖蜜8-10g/l，玉米淀粉5-7g/l，酵母浸粉5.0-6.0g/l，豆粕粉5.9-6.5g/l，ph调节为7.0-7.4；补料培养基2的成分为k2hpo42.4-2.6g/l，mnso4·h2o0.80-0.86g/l，nacl4.8-5.2g/l，cacl20.38-0.42g/l，氯化镧0.1-0.2g/l，ph调节为7.0-7.4，补加量均为发酵培养基体积的9-11%。

所述步骤5）中，辅助包覆处理的条件为超声温度60℃，超声时间50min。

所述应用为将本发明的生物农药微囊缓释剂用于防治大豆菌核病，其田间防效可达71.80%。

本发明的有益技术效果是：

（1）本发明利用低频电磁场辐射的生物效应，对芽孢杆菌种子液进行间歇性低频电磁场辐射处理，能够提高芽孢杆菌的生长代谢速率，使其在发酵培养过程中具有更好的营养物质利用率，更强的生长繁殖能力，有利于提高发酵液中的菌体数及芽孢率。

（2）本发明优化了芽孢杆菌发酵培养条件，并采用分段补料发酵的方法，分别在芽孢杆菌对数期和稳定期补加不同成分的补料培养基，显著提高了发酵液中的菌体数和芽孢率，为进一步的产业化生产奠定基础。

（3）本发明采用新型微囊技术，并对微囊化过程进行优化，将芽孢杆菌制备成微囊缓释剂。与传统生物农药剂型相比，该剂型可以在较长时间内保持有效成分的活性，不仅增加菌体的储存稳定性，延长制剂的货架期，显著提高对病害防治的稳定性，而且解决了可湿性粉剂存在的粉尘污染问题，对环境友好。将本发明的生物农药用于大豆菌核病的防治，其防治效果与常规化学药剂无显著差异，而且对环境无污染，具有广阔的发展前景。

附图说明

图1：接种量对菌体数和芽孢数的影响；

图2：发酵温度对菌体数和芽孢数的影响；

图3：发酵培养基ph对菌体数和芽孢数的影响；

图4：微囊芯与微囊壁材料的比例对包封率的影响；

图5：超声时间对包封率的影响。

具体实施方式

实施例1芽孢杆菌的发酵培养

1）菌种活化：无菌条件下分别将环蜡状芽孢杆菌（保藏编号为acccbcbkl0055）和解淀粉芽孢杆菌（保藏编号为accc60428）的保藏菌种转接至lb斜面培养基，置于30℃恒温培养12h，如此转接3次使菌种恢复活性。

2）种子液的制备：取活化后的蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，分别以2%的接种量接入种子培养基（成分为牛肉膏5g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖5g/l，nacl5g/l，k2hpo41.5g/l，ph调节为7.0）中进行摇瓶培养24h，在培养过程中对种子液每隔3h施加低频电磁场辐射1h，低频电磁场的参数为频率60hz，电场强度1000v/m，磁场强度0.3mt；摇瓶培养的条件为：装液量100ml/500ml，培养温度30℃，摇床转速180rpm。

3）分段补料发酵培养：以5%的总接种量将蜡状芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌种子液接入发酵培养基（成分为糖蜜9g/l，玉米淀粉6g/l，酵母浸粉5.5g/l，豆粕粉6.3g/l，k2hpo41.25g/l，kh2po40.33g/l，mnso4·h2o0.43g/l，nacl5.0g/l，mgso4·7h2o0.68g/l，cacl20.21g/l，聚乙烯醇1.8g/l）中，二者接种比例为2:3，培养基ph调节为7.2，发酵罐装液量为45%，发酵温度为35℃，通气量为1.2vvm，转速为240rpm，在芽孢杆菌生长进入对数期即发酵培养7h开始，每隔8h补加1次补料培养基1（成分为糖蜜9g/l，玉米淀粉6g/l，酵母浸粉5.5g/l，豆粕粉6.3g/l，ph调节为7.2），一共补加3次，在芽孢杆菌生长进入稳定期即发酵培养30h开始，补加1次补料培养基2（成分为k2hpo42.5g/l，mnso4·h2o0.83g/l，nacl5.0g/l，氯化镧0.15g/l，cacl20.40g/l，ph调节为7.2），补加量均为发酵培养基体积的10%，总发酵时间为39h。

菌体数及芽孢数的检测

a）菌体数：取发酵液用无菌水进行梯度稀释，采用平皿计数法统计菌体数；b）芽孢数：取发酵液在致死温度（75-80℃）下水浴处理15min，迅速冷却后用无菌水进行梯度稀释，采用平皿计数法统计芽孢数；芽孢率（%）=芽孢数/菌体数×100%。

实施例2发酵培养条件的优化

1）接种量对菌体数和芽孢数的影响：分别将实施例1中种子液的总接种量设置为1%、3%、5%、7%，其他条件相同，发酵结束后取发酵液进行菌体数及芽孢数的检测，结果如图1所示。接种量增加，菌体会快速生长并形成芽孢，但接种量超出一定范围时，由于微生物之间竞争生存空间与培养基的营养成分，同时产生过多的代谢废物，从而影响菌体继续增殖以及芽孢的进一步转化。从图1可知，接种量为5%时其菌体数和芽孢数最高，高于或低于5%时菌体数和芽孢数均有所下降，因此，以5%为最佳接种量。

2）发酵温度对菌体数和芽孢数的影响：分别将实施例1中发酵温度设置为25、30、35、40℃，其他条件相同，发酵结束后取发酵液进行菌体数及芽孢数的检测，结果如图2所示。发酵温度是影响微生物生长的重要因素之一，温度的高低与发酵过程中的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率等密切相关，从而影响菌体生长。从图2可知，发酵温度为35℃时其菌体数和芽孢数最高，高于或低于35℃时菌体数和芽孢数均有所下降，因此，以35℃为最佳发酵温度。

3）发酵培养基ph对菌体数和芽孢数的影响：分别将实施例1中发酵培养基ph设置为6.8、7.2、7.6、8.0，其他条件相同，发酵结束后取发酵液进行菌体数及芽孢数的检测，结果如图3所示。ph能影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收，是微生物生长的重要因素之一。从图3可知，发酵培养基ph为7.2时其菌体数和芽孢数最高，高于或低于7.2时菌体数和芽孢数均有所下降，因此，以7.2为最佳发酵培养基ph。

对比例1

1）菌种活化：与实施例1中相同；

2）种子液的制备：取活化后的蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，分别以2%的接种量接入种子培养基（成分与实施例1中相同）中进行摇瓶培养24h，摇瓶培养的条件为：装液量100ml/500ml，培养温度30℃，摇床转速180rpm；

3）分段补料发酵培养：与实施例1中相同；

发酵结束后取发酵液进行菌体数及芽孢数的检测，并与实施例1进行对比，比较低频电磁辐射对菌体数和芽孢数的影响，结果如表1所示。从表1可知，按照本发明的方法对种子液间歇性施加低频电磁场辐射，然后接种进行发酵培养，使得菌体数从对比例1的4.37×10¹¹cfu/ml提高至实施例1的5.15×10¹¹cfu/ml，芽孢率从85.58%提高至94.17%。低频电磁场是指频率较低，一般处于0~300hz的电磁场，随着电工技术的发展，用电设施日益增多，因此低频电磁场在现代化社会中分布十分广泛。在试验中我们发现利用低频电磁场辐射的生物学效应，对芽孢杆菌种子液进行间歇性低频电磁场辐射处理，能够提高芽孢杆菌的生长代谢速率，使其在发酵培养过程中具有更好的营养物质利用率，更强的生长繁殖能力，在相同的发酵时间内能获得更多的菌体数和芽孢数。

对比例2

1）菌种活化：与实施例1中相同；

2）种子液的制备：与实施例1中相同；

3）发酵培养：以5%的总接种量将蜡状芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌种子液接入发酵培养基（成分与实施例1相同）中，二者接种比例为2:3，培养基ph调节为7.2，发酵罐装液量为45%，发酵温度为35℃，通气量为1.2vvm，转速为240rpm，总发酵时间为39h。

发酵结束后取发酵液进行菌体数及芽孢数的检测，并与实施例1进行对比，比较低频电磁辐射对菌体数和芽孢数的影响，结果如表2所示。从表2可知，按照本发明的方法进行分段补料发酵培养，使得菌体数从常规发酵培养的3.92×10¹¹cfu/ml提高至5.15×10¹¹cfu/ml，芽孢率从79.852%提高至94.17%，提升效果显著。本发明采用分段补料发酵方法，在芽孢杆菌对数期补加的补料培养基1主要是碳源和氮源，可以减少高浓度底物的反馈抑制，优化菌体生长速率，从而提高菌体数；在稳定期补加的补料培养基2主要是一些无机盐离子和氯化镧，可以提高芽孢的转化率，从而提高芽孢数。

实施例3微囊缓释剂的制备

1）微囊芯的制备：取实施例1中的发酵液在4℃和4000r/min的条件下离心15min，除去上清液后将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤2-3次，然后重悬于1.5%海藻糖溶液中，制成微囊芯。

2）微囊缓释剂的制备：称取β-环糊精溶于适量蒸馏水中，在50℃下水浴加热，磁力搅拌一段时间，直至完全溶解形成饱和水溶液作为微囊壁材料，将制备好的微囊芯以1:8（v/v）的比例加入上述微囊壁材料中，再置于超声波振荡器中进行辅助包覆处理，条件为超声温度60℃，超声时间50min，处理结束后待混合溶液冷却至室温再进行减压抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后置于40℃下真空干燥24h，即得微囊缓释剂。

实施例4微囊制备条件的优化

1）微囊芯与微囊壁材料的比例对包封率的影响：分别将实施例3中微囊芯与微囊壁材料的比例设置为1:4、1:6、1:8、1:10，其他条件不变，制备好微囊缓释剂后进行包封率检测，包封率=微囊中菌体数/投入菌体数×100%，结果如图4所示。从图4可知，当微囊芯与微囊壁材料的比例在1:4-1:8时，包封率不断增加，在1:8时达到最大值，在1:10时包封率有所下降。微囊壁材料的用量越多，包覆效果越好，包封率越高，但当微囊壁材料使用过多时，由于反应为可逆反应，使得包覆过程被抑制反而降低了包封率，因此以1:8为最佳微囊芯与微囊壁材料的比例。

2）超声时间对包封率的影响：分别将实施例3中超声时间设置为30、40、50、60min，其他条件不变，制备好微囊缓释剂后进行包封率检测，包封率=微囊中菌体数/投入菌体数×100%，结果如图5所示。由图5可知，当超声时间在30-50min时，其包封率不断增加，在50min时达到最大值，在60min时包封率有所下降，因此以50min为最佳超声时间。

实施例5微囊缓释剂储存稳定性试验

以实施例3制得的微囊缓释剂作为试验组1，以解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂（有效成分含量：10亿/克，厂家：先农生物）作为试验组2，以枯草芽孢杆菌水剂（有效成分含量：2亿/毫升，厂家：劳克农业）作为试验组3，同时在室温条件下储存12个月，每3个月检测菌体存活率，结果如表3所示。从表3可知，试验组1的微囊缓释剂在室温下储存期间，其菌体存活率变化不大，到第12个月时，其菌体存活率仍能达到93.25%，显著高于试验组2的可湿性粉剂和试验组3的水剂，说明本发明的微囊缓释剂可以有效保持菌体的活性，提高制剂的储存稳定性，延长制剂的货架期。

实施例6大豆菌核病田间防治试验

试验设在江苏省连云港市灌云县洋桥农场大豆种植基地，以实施例3制得的微囊缓释剂作为试验组1，以50%速克灵可湿性粉剂作为试验组2，以40%菌核净可湿性粉剂作为试验组3，以80%多菌灵可湿性粉剂作为试验组4，以清水作为对照组，进行大豆菌核病田间防治试验。4个试验组和1个对照组，每组重复3次，共15个小区，每小区约100株大豆，小区随机排列，四周留保护行。于大豆花期发病初期对茎叶进行喷雾施药，每隔7d施药1次，共施药3次。在第3次施药后7d调查病株数及病情指数，计算防治效果，结果如表4所示。从表4可知，试验组1对大豆菌核病的防治效果达到71.80%，与其它化学药剂试验组的防治效果没有显著差异，说明本发明的生物农药微囊缓释剂可有效控制大豆菌核病的危害和发展，并且该制剂对环境无污染，适宜推广使用。

病情分级标准：0级，茎叶无病斑；1级，茎叶初现零星小病斑；2级，病斑占茎叶1/4以下；3级，病斑占茎叶1/4-1/2；4级，病斑占茎叶1/2以上。

病情指数=[σ（各级病株数×相应级数）/（调查总株数×最高级数）]×100%

防治效果=[（对照组病情指数-试验组病情指数）/对照组病情指数]×100%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。