本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法。
背景技术：
疼痛是困扰人类的一大顽疾，2000年被世卫组织列为第五大生命体征，73％的人一生中会出现严重的疼痛，最常见的神经病理性疼痛有椎间盘源性疼痛及神经损伤后疼痛，临床上仅腰背痛就有多达159种病因，随着老龄化的到来及交通工具日益增多，脊柱退变及损伤导致的神经病理性疼痛日益增多，且因其病因复杂，诊断标准界定困难，治疗方法不确切，误诊误治现象严重，很难得到早期、有效、规范的诊治，严重影响了临床疗效，给患者家庭及社会带来沉重负担，极大影响人民健康水平和社会发展，因此，神经病理性疼痛研究就成为前沿课题之一；
目前慢性神经病理性疼痛缺乏特异和有效的治疗，而背根神经节(drg)作为疼痛信号传入的初级神经元与必经之路，是疼痛药物治疗及分子治疗的最合适部位，同时drg作为治疗靶点具有非常高的安全性和耐受性，2012年美国fda已批准开展经椎间孔入路针对drg的疼痛相关治疗，而临床试验也发现经椎间孔入路drg注射治疗及电刺激治疗很少出现神经损伤等并发症，具有较高的安全性；
基因疗法已经证实为一种可治疗慢性疼痛的具有潜力的新方法，在之前研究中发现使用腺相关病毒(aav)行基因转染已经成为一种有效的方法，可以将目的基因转移到有丝分裂后的外周感觉神经元，以最小的毒性维持对神经性疼痛的长期疗效，而在去年10月，美国fda于批准腺相关病毒(aav)用于临床治疗，前期我们研究发现针对背根神经节神经元细胞进行aav介导的基因转染治疗，并运用干扰肽适配体特异结合神经元表面影响疼痛传递的信号通路，并在动物试验中取得良好效果；
目前对drg基因治疗主要针对神经元细胞，而忽略了神经节中卫星胶质细胞(sgcs)在疼痛信号传递中的作用，神经节中卫星胶质细胞(sgcs)是疼痛信号传递通路上的一个重要部分，神经损伤后的sgc增殖和活化通过多种机制影响感觉信号传递，包括基因表达的改变，增加sgcs之间和sgcs和神经元间的耦合；诱导小胶质细胞激活的趋化因子/细胞因子释放，对sgc特异性分子(诸如连接蛋白43(cx43)、谷氨酰胺合成酶(gs)、atp敏感型内向整流钾通道10(kir4.1)、兴奋性氨基酸转运蛋白1(eaat1)、嘌呤能离子型p2x7受体(p2x7r)和gfap)的基因修饰，可以显著改变正常和神经损伤的啮齿类动物的对感觉的反应，因此，在背根神经节(drg)中针对sgc的基因疗法可以为慢性疼痛的治疗提供新的思路，而针对drg中sgcs的特异性转染技术在国内外尚属空白，所以现在需要设计可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法来解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，包括以下步骤：
步骤一：取得适量paav-gfap-egfp表达质粒、prep2/cap6(prc6)、prc8和phelper进行aav病毒的生产，准备足量的裂解缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，2mmmgcl2，ph8.0)、100u/ml的benzonase(sigma-aldrich)、含有2.5nnacl的40％peg8000(sigma-aldrich)的储存溶液、含有1mmcacl2和2mmkcl的磷酸盐缓冲盐水(pbs)、40mlquick-seal离心管、18号针头、centriconplus-20(regeneratedcellulose100，000mwco，millipore，bill-erica，ma)、含有5％山梨糖醇(sigma-aldrich)的pbs、氨苄青霉素抗性基因、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)、pierce银染色试剂盒(fisherscientific，rockford，il)、小鼠抗vp1，-2，-3抗体(1：1000稀释；researchdiagnosticinc.)、1％alcianblue(electronmicroscopysciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；electronmicroscopysciences，hatfield，pa)、1％乙酸双氧铀(electronmicroscopysciences)、jeol2100和hitachi600透射电子显微镜；
步骤二：取得适量的aav病毒，采用optirep(sigma-aldrich，stlouis，mo，usa)梯度离心纯化；
步骤三：通过用prc6或prc8和phelper质粒将capo4共转染paav-gfap-egfp到293t细胞中来产生aav载体；
步骤四：转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，2mmmgcl2，ph8.0)中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物a，将细胞裂解物a通过2500g离心30分钟澄清得到细胞裂解物b，将细胞裂解物b与100u/ml的benzonase(sigma-aldrich)在37℃温育1小时得到细胞裂解物c，将含有2.5nnacl的40％peg8000(sigma-aldrich)的储存溶液加入到细胞裂解物中至终浓度为8％，然后将溶液在冰上温育2小时，以2500g离心30分钟，并将沉淀在含有1mmcacl2和2mmkcl的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中分离；
步骤五：进行纯化病毒载体完整性验证；
步骤六：取2μl构建的腺相关病毒载体，通过微量注射器缓慢注射至sd大鼠drg，注射完毕5min后缓慢撤出针头，病毒转染后5周将动物安乐死，drg包埋切片，使用gfp抗体通过免疫荧光分析egfp表达的细胞特异性；
步骤七：aav6-gfap-egfp成功转染后egfp在tubb3标记的初级感觉神经元胞体周围呈环状表达，其中egfp信号位于tubb3阳性的神经元细胞及nkaα1标记的神经元质膜之外，与gfap染色高度共定位；
步骤八：评估载体注射后sgc转导的比率，对围绕神经元的环形sgc行免疫组织化学检测：于注射aav6-gfap-egfp的drg，有70％±8％的神经元周围观察到egfp阳性的环形sgc，而只有少数神经元胞体egfp呈阳性(～1％)，得到本项目构建的病毒载体可特异性的在sgcs中表达的结果。
优选的，所述步骤一中paav-gfap-egfp表达质粒含有自身互补(sc)aav2反向末端重复序列(itr)，并通过gfap启动子驱动嵌合内含子增强下游的egfp转录，所述rep2/cap6(prc6)和prc8(viromics，fremont，ca，usa)分别含有来自aav6或aav8的aav2复制(rep)和衣壳(cap)蛋白基因；所述编码腺病毒辅助基因的phelper(viromics)。
优选的，所述步骤二中optiprep纯化aav的方法包括以下步骤：
s1：用40mlquick-seal离心管行optiprep梯度离心(beckmaninstruments，paloalto，ca，usa)，梯度分别为10ml，15％；8ml，25％；6ml，40％，2ml，60％；
s2：将15毫升aav病毒进行裂解梯度离心，在70℃下在70ti转子(beckmaninstruments)中以18℃离心70分钟，用18号针头从40-60％的之间和40％的下层1/2部分提取病毒；
s3：用centriconplus-20(regeneratedcellulose100，000mwco，millipore，bill-erica，ma)浓缩获得的病毒悬浮液，并将最终的病毒制剂保持在含有5％山梨糖醇(sigma-aldrich)的pbs中，并在-80℃下储存；
s4：用picogreen法(invitrogen，carlsbad，ca，usa)测定相对于标准质粒的载体基因组，并且还在aav载体变性后行点状印迹，使用氨苄青霉素抗性基因为引物行pcr检测，未发现纯化的aav载体基因组中的aav质粒污染，计算病毒滴度，单位为每ml的基因组拷贝数(gc/ml)，aav6-egfp和aav8-egfp载体的滴度分别为2.161013gc/ml和2.561013gc/ml。
优选的，所述步骤五中进行纯化病毒载体完整性验证方法包括以下步骤：
b1：首先通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳评估载体的纯度，然后使用pierce银染色试剂盒(fisherscientific，rockford，il)进行银染色；
b2：使用小鼠抗vp1，-2，-3抗体(1：1000稀释；researchdiagnosticinc.)通过标准免疫印迹程序确认病毒衣壳蛋白；
b3：用nihimagej软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)定量vp1：vp2：vp3蛋白的比例和相对于凝胶上可见的非载体蛋白的纯度，进行负染色和电子显微镜(em)扫描以评估纯化的aav载体的颗粒含量；
b4：用1％alcianblue(electronmicroscopysciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；electronmicroscopysciences，hatfield，pa)并加载5ml病毒载体，洗涤网格，用1％乙酸双氧铀(electronmicroscopysciences)染色，并用jeol2100和hitachi600透射电子显微镜观察；
b5：通过直接计数电子显微照片确定颗粒比率。
优选的，所述aav病毒制剂批次均为同一批次。
本发明提出的可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，有益效果在于：本发明成功构建含有gfap启动子的aav载体，aav载体因安全性较高已经被美国fda批准可供人体内使用，该载体能特异性在drg内转染sgcs，为后续基因治疗创造了条件。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一：可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，包括以下步骤：
步骤一：取得适量paav-gfap-egfp表达质粒、prep2/cap6(prc6)、prc8和phelper进行aav病毒的生产，所述paav-gfap-egfp表达质粒含有自身互补(sc)aav2反向末端重复序列(itr)，并通过gfap启动子驱动嵌合内含子增强下游的egfp转录，所述rep2/cap6(prc6)和prc8(viromics，fremont，ca，usa)分别含有来自aav6或aav8的aav2复制(rep)和衣壳(cap)蛋白基因；所述编码腺病毒辅助基因的phelper(viromics)，准备足量的裂解缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，2mmmgcl2，ph8.0)、100u/ml的benzonase(sigma-aldrich)、含有2.5nnacl的40％peg8000(sigma-aldrich)的储存溶液、含有1mmcacl2和2mmkcl的磷酸盐缓冲盐水(pbs)、40mlquick-seal离心管、18号针头、centriconplus-20(regeneratedcellulose100，000mwco，millipore，bill-erica，ma)、含有5％山梨糖醇(sigma-aldrich)的pbs、氨苄青霉素抗性基因、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)、pierce银染色试剂盒(fisherscientific，rockford，il)、小鼠抗vp1，-2，-3抗体(1：1000稀释；researchdiagnosticinc.)、1％alcianblue(electronmicroscopysciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；electronmicroscopysciences，hatfield，pa)、1％乙酸双氧铀(electronmicroscopysciences)、jeol2100和hitachi600透射电子显微镜；
步骤二：取得适量的aav病毒，采用optirep(sigma-aldrich，stlouis，mo，usa)梯度离心纯化：用40mlquick-seal离心管行optiprep梯度离心(beckmaninstruments，paloalto，ca，usa)，梯度分别为10ml，15％；8ml，25％；6ml，40％，2ml，60％，将15毫升aav病毒进行裂解梯度离心，在70℃下在70ti转子(beckmaninstruments)中以18℃离心70分钟，用18号针头从40-60％的之间和40％的下层1/2部分提取病毒；用centriconplus-20(regeneratedcellulose100，000mwco，millipore，bill-erica，ma)浓缩获得的病毒悬浮液，并将最终的病毒制剂保持在含有5％山梨糖醇(sigma-aldrich)的pbs中，并在-80℃下储存；用picogreen法(invitrogen，carlsbad，ca，usa)测定相对于标准质粒的载体基因组，并且还在aav载体变性后行点状印迹，使用氨苄青霉素抗性基因为引物行pcr检测，未发现纯化的aav载体基因组中的aav质粒污染，计算病毒滴度，单位为每ml的基因组拷贝数(gc/ml)，aav6-egfp和aav8-egfp载体的滴度分别为2.161013gc/ml和2.561013gc/ml，本实验中所述aav病毒制剂批次均为同一批次；
步骤三：通过用prc6或prc8和phelper质粒将capo4共转染paav-gfap-egfp到293t细胞中来产生aav载体；
步骤四：转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，2mmmgcl2，ph8.0)中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物a，将细胞裂解物a通过2500g离心30分钟澄清得到细胞裂解物b，将细胞裂解物b与100u/ml的benzonase(sigma-aldrich)在37℃温育1小时得到细胞裂解物c，将含有2.5nnacl的40％peg8000(sigma-aldrich)的储存溶液加入到细胞裂解物中至终浓度为8％，然后将溶液在冰上温育2小时，以2500g离心30分钟，并将沉淀在含有1mmcacl2和2mmkcl的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中分离；
步骤五：进行纯化病毒载体完整性验证：首先通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳评估载体的纯度，然后使用pierce银染色试剂盒(fisherscientific，rockford，il)进行银染色；使用小鼠抗vp1，-2，-3抗体(1：1000稀释；researchdiagnosticinc.)通过标准免疫印迹程序确认病毒衣壳蛋白；用nihimagej软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)定量vp1：vp2：vp3蛋白的比例和相对于凝胶上可见的非载体蛋白的纯度，进行负染色和电子显微镜(em)扫描以评估纯化的aav载体的颗粒含量；用1％alcianblue(electronmicroscopysciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；electronmicroscopysciences，hatfield，pa)并加载5ml病毒载体，洗涤网格，用1％乙酸双氧铀(electronmicroscopysciences)染色，并用jeol2100和hitachi600透射电子显微镜观察；通过直接计数电子显微照片确定颗粒比率；
步骤六：取2μl构建的腺相关病毒载体，通过微量注射器缓慢注射至sd大鼠drg，注射完毕5min后缓慢撤出针头，病毒转染后5周将动物安乐死，drg包埋切片，使用gfp抗体通过免疫荧光分析egfp表达的细胞特异性；
步骤七：aav6-gfap-egfp成功转染后egfp在tubb3标记的初级感觉神经元胞体周围呈环状表达，其中egfp信号位于tubb3阳性的神经元细胞及nkaα1标记的神经元质膜之外，与gfap染色高度共定位；
步骤八：评估载体注射后sgc转导的比率，对围绕神经元的环形sgc行免疫组织化学检测：于注射aav6-gfap-egfp的drg，有70％±8％的神经元周围观察到egfp阳性的环形sgc，而只有少数神经元胞体egfp呈阳性(～1％)，得到本项目构建的病毒载体可特异性的在sgcs中表达的结果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。