蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法与流程

本发明涉及一种蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：蝙蝠群体数量庞大，是仅次于啮齿类的第二大类哺乳动物群(pattersonetal.1994)。蝙蝠携带的病原体种类较多，包括病毒、细菌和寄生虫等。目前，在蝙蝠体内已检测到60多种人畜共患病病毒，其中包含对人类高度致病的埃博拉病毒、狂犬病毒、马尔堡病毒和sars样冠状病毒等。轮状病毒属于呼肠病毒属轮状病毒科，是导致幼龄动物、禽类和婴幼儿腹泻的主要病原体。病毒粒子呈圆形，形似车轮辐条，无包膜，大小为65-75nm，由外层衣壳，内层衣壳和核心衣壳三层衣壳组成，核衣壳内包裹病毒核酸。基因组由11个独立节段的双链rna构成，分别编码6个结构蛋白和5个非结构蛋白(nsp1-5)。由于轮状病毒基因组具有节段性的特点，当两株以上轮状病毒存在于同一个宿主时，极易发生轮状病毒片段之间的重组，从而产生重组病毒株。根据vp6蛋白的差异，轮状病毒可以分为a-g群，a群轮状病毒是感染人和其他哺乳动物最常见的血清型。2007年，esona等首次在肯尼亚棕色果蝠体内检测到轮状病毒，扩大了轮状病毒的宿主范围。2012何彪等在中国云南的小菊头蝠体内检测到轮状病毒，利用marc-145细胞成功分离到第一株蝙蝠源轮状病毒株mshl14。此后，越来越多新的轮状病毒株在世界各地不同种类的蝙蝠体内被检出。中国舟山群岛地处东南沿海地区，岛屿众多，气候湿热，是自然疫源性疾病的高发地带。本课题组前期在舟山地区蝙蝠检测到了博卡病毒、圆环病毒和sars样冠状病毒。为了解该地区蝙蝠轮状病毒的流行和分布情况，设计针对轮状病毒特异性引物，筛选阳性标本，获取基因组序列后进行同源性分析和构建进化树，以确定病毒来源和基因差异程度，对研究蝙蝠源轮状病毒具有重要意义。技术实现要素：1、发明目的。本发明提出了一种具有高特异性和灵敏度的蝙蝠源轮状病毒基因组筛查及扩增方法。2、本发明所采用的技术方案。本发明公开了蝙蝠源轮状病毒基因组vp3，其dna序列如seqidno.1所示。本发明公开了蝙蝠源轮状病毒基因组vp6，其dna序列如seqidno.2所示。本发明公开了蝙蝠源轮状病毒基因组vp7，其dna序列如seqidno.3所示。本发明还公开了一种用于快速筛查蝙蝠源轮状病毒的引物对1，其上游引物序列如seqidno.4所示，下游引物序列如seqidno.5所示。应用引物对1对蝙蝠肠组织提取的cdna进行pcr，经琼脂糖凝胶电泳显示和目的条带大小一致的条带后，对应pcr产物送公司测序验证，验证序列blast比对为轮状病毒vp3序列，即证明对应的蝙蝠肠组织标本携带轮状病毒。具体筛查电泳图见图1。上述引物对在快速筛查蝙蝠源轮状病毒中的应用。本发明还公开了一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增引物对，其特征在于：包括以下4对引物：引物对2:vp3f1:5’-ggctattaaagcagtattag-3’(seqidno.6)；vp3r1603:5’-tgaggttattatggcatcg-3’(seqidno.7)；引物对3:vp3f1500:5’-cgcttattactgtgagaatc-3’(seqidno.8)；vp3r2591:5’-ggtcacatcatgactagtgtg-3’(seqidno.9)；引物对4：vp7f1：5’-ggctttaaaagagagaatttccg-3’(seqidno.10)；vp7r1062：5’-ggtcacatcatacaattctaatc-3’(seqidno.11)；引物对5:vp6f160：5’-tggdggaattggyaatttrcc-3’(seqidno.12)；vp6r1356：5’-ggtcacatcctctcactat-3’(seqidno.13)。一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增方法，分别以上述的引物对2-5作为扩增的上下游引物，以蝙蝠样本中提取的轮状病毒rna模板进行rt-pcr扩增，分别得到扩增引物，连接至t载体，利用m13通用引物进行测序，测序结果通过dnaman拼接比对，得到蝙蝠源轮状病毒基因组全长序列。优选的，所述的rt反转录反应体系为：含有5×rt缓冲液5μl，50μμoligdt/randomhexamer引物混合液2μl，10mmdntps1.5μl，m-mlvrtase/rnainhibitor混合液1μl，rna模板7.5μl,加rnase-freeh2o8μl补足至25μl，反应条件：42℃水浴1h，75℃灭活10min。优选的，所述的pcr反应体系为：5×primestargxlbuffer5μl、2.5mm的dntpmixture2μl、10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.5μl、cdna模板1μl、primestargxldnapolymerase0.5μl，其余由双蒸水补足至25μl，其反应条件为：以引物对2作为引物的反应条件为：98℃预变性10s；65℃15s、68℃30s，共35个循环；以引物对3、4、5作为引物的反应条件为：98℃预变性10s；65℃15s、68℃90s，共35个循环。上述的引物对在扩增得到蝙蝠源轮状病毒基因组序列中的应用。3、本发明所产生的技术效果。本发明针对蝙蝠源轮状病毒基因组结构特征和参考已知蝙蝠轮状病毒基因组序列，根据其基因组所包括的开放阅读框设计了分段扩增引物。并根据保守区域设计相应的扩增引物，能有效的扩增蝙蝠源轮状病毒全基因组序列。本发明可以广泛应用于蝙蝠源轮状病毒检测需求及相应的科研领域。附图说明图1为利用引物对1筛选轮状病毒的电泳图。图2为引物对2扩增后的电泳图。图3为引物对3扩增后的电泳图。图4为引物对4扩增后的电泳图。图5为引物对5扩增后的电泳图。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例1：蝙蝠样本中病毒基因组的扩增效果(1)病毒样品处理剪取大概火柴头大小的菲菊头蝠的蝙蝠肠道组织样本(菲菊头蝠取自浙江舟山地区)，于玻璃研磨器中，加入1mlpbs进行研磨，直至肉眼看不到组织块为止。将研磨液转移到1.5mlep管中，以12000rpm/min，4℃离心10min，用2ml注射器吸取研磨液上清，经0.22μm滤膜过滤，去除组织块以及细菌病原，收集滤液。(2)病毒样品rna提取将消化液使用qingen公司的rneasyminikit提取试剂盒进行rna提取。具体操作如下：1).在通风橱中，rlt裂解液预先按照1:1000(v/v)加入β-巯基乙醇；2).每150μl消化液加入350μl的a)中的rlt，剧烈振荡30秒，室温静置5min；3).将b)的全部裂解液中加入500μl70％的乙醇，颠倒混匀。然后取700μ样品移到rneasymini收集管中的过滤柱上，12000g离心1min；4).离心后，弃滤液，向过滤柱加入700μlrw1试剂，12000g离心1min；5).弃滤液，向过滤柱加入500μlrpe试剂，12000g离心1min，并且重复该步骤一次；6).把过滤柱转移到新的1.5ml的离心管内，晾干，并加入35μlrnasefreeh2o溶解rna，同时用nanodrop测定rna质量。(3)病毒rna逆转录体系5×rt缓冲液5μl50μμoligdt/randomhexamer2μl10mmdntps1.5μlm-mlvrtase/rnainhibitor1μlrna模板7.5μlrnase-freeh2o8μl反应条件：42℃水浴1h，75℃灭活10min。(4)pcr反应体系5×primestargxlbuffer5μldntpmixture(2.5mm)2μl上、下游引物(20μmol/l)0.5μlprimestargxldnapolymerase0.5μlcdna模板1μlrnase-freeh2o16μlpcr反应条件*引物对1和2,68℃延伸时间为30s，其余引物对延伸时为90s(5)基因组分段扩增采用上述引物对2、3、4和5进行扩增，扩增片段经凝胶电泳鉴定后连接t载体，转入感受态克隆培养，提取质粒后，用m13通用引物进行测定。(6)电泳、pcr产物序列测定：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。采用引物对1对2015-2018年舟山地区蝙蝠标本进行筛选，从284个蝙蝠标本中筛选出7个携带轮状病毒的蝙蝠标本，携带率为2.7％(7/284)。vp3、vp6和vp7基因节段序列，长度分别为2591bp、1139bp和981bp。上述序列经blast比对发现，vp3序列与三株人源轮状病毒rva/human-wt/chn/e2451/2011/g3p[9]、rva/human-tc/kor/cau14-1-262/2014/g3p[9]和rva/human-tc/chn/l621/2006/g3p[9]以及一株蝙蝠源轮状病毒rva/bat-wt/chn/lzhp2/2015/g3p[3]同源性最高，均为90％。vp6序列与猫来源的轮状病毒株rva/cat-tc/jpn/frv317/1994/g3p[9]同源性最高为95％，与lzhp2的vp6序列同源性为90％。vp7序列与一株蝙蝠来源的轮状病毒株batrv/bb89-15/rhi_bla/bgr/2008同源性高达96％，与何彪等在中国西南地区发现的蝙蝠轮状病毒株bat-wt/chn/lzhp2/2015/g3p[3]同源性94％。本申请中，轮状病毒基因组gc含量低，其中at比值高达65％，引物设计存在困难；另一方面，由于轮状病毒不同基因片段之间经常发生重组，因此无法确定用于设计引物的比对序列。本申请中使用的筛选引物对1是基于舟山地区蝙蝠高通量注释到的vp3片段设计的，利用balst比对出相似度最高的8条序列，用dnaman进行多序列比对，选取8条vp3序列中基因较为保守的区域设计的上下游引物。刚开始由于不清楚舟山地区蝙蝠轮状病毒株各基因片段基因型，对于除vp3片段以外的基因节段所设计的引物对，均不能扩增筛查出阳性病毒株，通过该引物对1进行pcr，凝胶电泳后呈现的条带单一，特异性高。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心<120>蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2591<212>dna<213>batrotavirus<400>1ggcttttaaagcagtacgagtagtgtgttttacctctgatggtgtaaacatgaaagtact60agctttaagacacagtgtggctcaggtatatgcagacactcaagtctacactcatgatga120tactaaagatagttacgaaaatgcatttctcatatctaatcttaccacgcataatatctt180atatttaaattacagtaataaaacacttgaaatactgaacaaatcaggaattgcggctgt240cgaaattcaatctctcgaagagctgtttactctaattagatgtaactttacttatgatta300tgaaaataacataatttatttgcatgattactcatactacactaataatgagataaggac360tgatcaacattgggttacaaaaactaacattgaagaatatttgctgccaggatggaaatt420aacgtatgtgggctataatggaagtgatactagagggcattataatttctcattcacatg480tcagaatgctgcaaccgacgatgacttaataat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