鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记及其开发方法和应用与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记及其开发方法和应用。
背景技术：
：植物表皮毛由表皮细胞发育而来，处于植物表皮层与环境之间，为植物提供了一道天然的物理屏障。有些表皮毛通过分泌驱逐剂、生物碱或有毒物质来防御生物侵害，使植物免受食草性动物、昆虫的伤害及病原体的感染。在抵抗非生物胁迫方面，表皮毛不但可以减轻冷冻、紫外线损害和机械损伤等，而且可减少植物体内水分的流失及热量的过多积累和损耗。芸薹属物种中，表皮毛广泛存在于白菜、芥菜、甘蓝型油菜和几个野生甘蓝中，然而目前所有的栽培甘蓝均为无表皮毛类型，比如结球甘蓝、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、芥蓝和抱子甘蓝等。有一种野生类型(b.incana)具有相当突出的抗生物胁迫能力，该野生甘蓝具有一个显著特点，即其周身均覆盖着表皮毛，且具有突出的抗病虫能力。因此，利用野生甘蓝资源培育具有表皮毛的栽培甘蓝，对提高栽培甘蓝的抗病虫、耐干旱及冻害能力，减少农药施用量与成本投入都有积极意义。模式植物拟南芥表皮毛的形成机制基本被阐明，超过30个基因已被证实参与表皮毛的形成和发育。其中，gl1、ttg1和gl3共同形成一个三聚体复合激活因子gl1-gl3-ttg1，促进gl2基因的表达，进而调控表皮毛的发育。与上述正调节因子相反，try是拟南芥中调控表皮毛发育的主要负调节因子，能与gl3的末端相互作用，与gl1竞争性地结合到bhlh蛋白上，形成try-gl3-ttg1复合体，从而抑制表皮毛的发育。目前，通过图位克隆技术已经确认brttg1是白菜表皮毛形成的调节因子。同时，brgl1基因的的核苷酸多态性也与白菜叶片表皮毛有关，但控制野生甘蓝表皮毛的基因尚未见报道。目前针对甘蓝表皮毛性状的遗传育种中，采用的仍是传统的杂交育种方法，这种育种方式效率低，占用土地空间大。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明公开一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02，该分子标记与甘蓝表皮毛性状紧密相关，本发明还公开该分子标记的开发方法，并公开该分子标记在甘蓝育种中的应用，可大规模精准鉴定甘蓝表皮毛分离群体中杂合与纯合基因型，使后代选择更具针对性，提高甘蓝遗传育种的效率，并减小育种占用的土地空间。本发明通过下述技术方案实现：鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。aaacctctccaacaaagcccactctctctttctctctagatacaagatagtataataaaagagtttgccacctctcttctctgctctctcttcagtttctcatactttcctcttccacctccattgatggattcaacgtatcgacgtcagcgtcacaactctgaaggtccatctcatataatgtgtttgattagcttattacatatgcatgctctttcttcataaccatattttatttcctttggacatagtcaatagtcatcgtgtttagctgaagttcatgttatcatatattatatttccctaattaaccagactcttcgtagccttaattatcacatatatgtagttacgcgattgtgaataaacacaccaataacaaacttcgtagccttttattatatatatagccctaattgtatttacgtgaatgtgaaataagtatttacgagcagagatgagatcaagaaggacatgagattattacatacgtagcgattagcaaaagagaatataaaaatattggagcaaaaagtaaaagttttgtgttgtttttgataaatgcagaagtgtgtagcgtaaagtgg该分子标记总长587bp，snp出现在157bp，下划线所示为snp，无毛甘蓝为a，有毛甘蓝为g，酶切位点在131-132bp、157-158bp和316-317bp之间，该分子标记的扩增产物在酶切时所使用的限制性内切酶为hinfi。鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02的引物，其正向引物具有如seqidno.2所示的核苷酸序列(5’-aaacctctccaacaaagccca-3’)，反向引物具有如seqidno.3所示的核苷酸序列(5’-ccactttacgctacacacttc-3’)。鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02的开发方法，包括以下步骤：1)以一份无毛甘蓝与一份有毛野生甘蓝b.incana杂交产生f1代，f1代自交获得f2代植株，1063个f2(含149个无性系f2群体和914个单株f2:3家系)中778个无毛，285个有毛，符合3:1的分离比例(卡方值＝1.628，p＞0.05，卡方检验不显著，符合3:1的遗传分离规律)，表明该野生甘蓝的表皮毛受隐性单基因控制；2)利用149个无性系f2群体构建甘蓝遗传连锁图谱(meietal,2013,tag126:549-556)，并将表皮毛基因定位到甘蓝c01染色体上一段4.3cm(17.56mb)区间；3)从f2群体中挑选无表皮毛和有表皮毛的个体各50株，对亲本和极端混池进行全基因组重测序，根据takagi等(takagietal.,2013,plantj74:174-183)方法，采用δ(snp-index)法鉴定与甘蓝表皮毛性状显著相关的差异热点区域，同时结合上述qtl定位结果，最后将甘蓝表皮毛性状定位在甘蓝c01染色体上1.04mb的区间内；4)通过与拟南芥的同源比对和基因注释信息，在上述区间内发现一个候选基因boltry-l，该基因与拟南芥调控表皮毛基因athtry具有类似功能，qrt-pcr分析显示，f2群体中候选基因boltry-l在无毛植株的表达量显著高于有毛植株(meietal.,2017,tag130:1953-1959)；5)进一步克隆有毛甘蓝和无毛甘蓝boltry-l基因的cds，序列比对发现，二者的cds序列存在snp。本发明还提供一种表皮毛有无的甘蓝品种鉴定方法，包括以下步骤：(1)以待鉴定甘蓝dna为模板，扩增分子标记bol.trichome-caps.02，引物为具有如seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列；(2)扩增产物利用限制性酶hinfi进行酶切，酶切后进行凝胶电泳，获得271-bp、185-bp、158-bp、131-bp和27-bp五种特异条带；(3)出现271-bp、158-bp、131-bp和27-bp四种特异条带的甘蓝植株，为纯合的有毛个体，出现271-bp、185-bp和131-bp三种条带的，为纯合的无毛植株，同时出现五种特异条带的为杂合个体。本发明还提供一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02在甘蓝育种中的用途。本发明还提供一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的用途。本发明还提供所述分子标记引物在甘蓝育种中的用途。本发明还提供所述分子标记引物在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的用途。本发明还提供一种甘蓝品种鉴定方法在甘蓝育种中的用途。本发明还提供一种甘蓝品种鉴定方法在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的用途。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本发明鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02，该分子标记与甘蓝表皮毛性状密切相关，可应用于甘蓝分子辅助育种，实现大规模精准鉴定甘蓝表皮毛分离群体中杂合与纯合基因型，使后代选择更具针对性，提高甘蓝遗传育种的效率，并减小育种占用的土地空间；2、本发明表皮毛有无的甘蓝品种鉴定方法，该方法利用与甘蓝表皮毛性状密切相关的分子标记bol.trichome-caps.02的引物，并经限制性酶hinfi进行酶切后电泳，达到鉴定甘蓝基因型的效果，利用该鉴定方法可极早判断筛选出杂合基因型植株，将其与纯合无毛植株进行区分，从而保留其进入下一轮选择，可增强育种选择的目的性，提高选择效率，缩短育种年限。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为本发明甘蓝两亲本的田间表皮毛性状图。图2上幅图为本发明甘蓝表皮毛bsa性状定位结果图，下幅图为c01染色体的放大图，候选基因的位置在14.43mb处。图3为本发明分子标记所使用的引物和限制性内切酶hinfi的酶切位点示意图(c01为有毛甘蓝亲本，c41为无毛甘蓝亲本，f后面的序列为正向引物序列，r后面的序列为反向引物序列，atg为起始密码子，白色加粗字母为snp位点，白色线条覆盖序列为hinfi可识别的碱基序列，黑色倒三角代表酶切位点，中间的碱基通过省略号表示)图4为本发明分子标记在有毛和无毛甘蓝中的检测情况示意图(m代表marker，c01代表有毛甘蓝亲本，c41代表无毛甘蓝亲本，f1代表杂种f1)。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例1本发明一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02的开发方法，包括以下步骤：1)以一份无毛甘蓝与一份有毛野生甘蓝b.incana杂交产生f1代，f1代再自交并种植于大田，获得1063个f2代植株(含149个无性系f2群体和914个单株f2:3家系)，在f2代植株的第四到第五叶期，通过肉眼观察表皮毛的有无，f2代植株中778个无毛，285个有毛，符合3:1的分离比例(卡方值＝1.628，p＞0.05)，表明该野生甘蓝的表皮毛受隐性单基因控制；2)利用149个无性系f2群体构建甘蓝遗传连锁图谱(meietal.,2013,tag126:549-556)，并将表皮毛基因定位到甘蓝c01染色体上一段4.3cm(17.56mb)区间；3)从f2群体中挑选了无表皮毛和有表皮毛的个体各50株，对亲本和极端混池进行全基因组重测序，根据takagi等(takagietal.,2013,plantj74:174-183)方法，采用δ(snp-index)法鉴定与甘蓝表皮毛性状显著相关的差异热点区域，同时结合上述qtl定位结果，最后将甘蓝表皮毛性状定位在甘蓝c01染色体上1.04mb的区间内，如图2所示；4)通过与拟南芥的同源比对和基因注释信息，根据对应功能注释和与植物表皮毛有关的现有文献，在上述区间内发现一个候选基因boltry-l，该基因与拟南芥调控表皮毛基因athtry具有类似功能，qrt-pcr分析显示，f2群体中候选基因boltry-l在无毛植株的表达量显著高于有毛植株(meietal.,2017,tag130:1953-1959)；5)进一步我们克隆了有毛甘蓝和无毛甘蓝boltry-l基因的cds，序列比对发现，二者的cds序列存在snp。6)根据该snp位点上下游序列，设计可扩增出上述snp位点的引物，如图3所示，其正向引物序列为5’-aaacctctccaacaaagccca-3’，反向引物序列为5’-ccactttacgctacacacttc-3’，扩增片段大小为587-bp。根据上述snp类型及附近序列，确定能辨别其碱基类型的限制性内切酶为hinfi。实施例2本发明本发明一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的应用过程，具体步骤如下：(1)以甘蓝单株幼苗期叶片dna为模板，扩增分子标记bol.trichome-caps.02，引物为具有如seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列；(2)pcr扩增产物每10μl用2.5u的限制性酶hinfi在37℃条件下处理1h，酶切后酶切产物经4％琼脂糖凝胶电泳，获得271-bp、185-bp、158-bp、131-bp和27-bp五种特异条带；(3)如图4所示，出现271-bp、158-bp、131-bp和27-bp四种特异条带的甘蓝植株，为纯合的有毛个体，出现271-bp、185-bp和131-bp三种条带的，为纯合的无毛植株，同时出现五种特异条带的为杂合个体，当代表现为无毛，后代有分离，可保留供进一步育种选择，最终达到培育和鉴定有毛甘蓝的目的。实施例3本发明一种鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记bol.trichome-caps.02在回交育种中的应用过程：如图1所示，以抗病无毛甘蓝c41和有毛甘蓝c01为亲本，杂交产生的f1继续与c41回交，得到80份bc1f1回交群体为研究材料，进行转移有毛性状(单隐形基因)到抗病无毛甘蓝c41的回交育种研究。其中80份材料都表现无毛，利用实施例1中所开发的分子标记进行基因型鉴定，步骤如下：1)以80份bc1f1回交群体幼苗期的叶片dna为模板；2)利用下述引物进行pcr扩增：正向引物序列为5’-aaacctctccaacaaagccca-3’，反向引物序列为5’-ccactttacgctacacacttc-3’，扩增片段大小为587-bp；3)pcr反应体系：总体积为10ul，具体成分如下：成分体积ddh2o6.7μl10×taqbuffer(含mg2+)1.0μldntps(10mm)0.2μl正向引物(50ng/μl)0.5μl反向引物(50ng/μl)0.5μltaqase(5u/μl)0.1μldna模板(50ng/μl)2.0μl总体积10.0μl4)pcr扩增程序：94℃5min，[94℃45s，55℃45s，72℃1min]×35循环，72℃10min。运行完毕后4℃条件下保存。5)pcr扩增产物的酶切：每10μl用2.5u的限制性酶hinfi在37℃条件下处理1h；6)酶切产物经4％琼脂糖凝胶电泳分离后，出现271-bp、185-bp和131-bp三种特异条带的有38份材料，推测为纯合的无毛植株；出现271-bp、185-bp、158-bp、131-bp和27-bp五种特异条带的有42份材料，推测为杂合基因型植株，二者比例接近1：1。7)随机选择步骤6)中出现271-bp、185-bp和131-bp三种特异条带的材料5份(无毛)、出现271-bp、185-bp、158-bp、131-bp和27-bp五种特异条带的材料5份(无毛)，分别自交并种植于大田后调查下一代植株表皮毛性状，结果发现，显示三种条带材料后代的表型都为无毛，且不发生分离，均与上代表型一致，即上代均为纯合的无毛植株；显示5条带材料后代的表型出现表皮毛性状的分离现象，即上代均为杂合基因型植株。上述鉴定结果表明，在转移甘蓝表皮毛的回交育种中，通过功能标记鉴定与筛选，保留出现271-bp、185-bp、158-bp、131-bp和27-bp五种特异条带的材料即为杂合单株，继续与轮回亲本c41进行第二次回交，理论每一代可减少50％的工作量。同时，借助分子标记辅助选择，在转移单隐形基因(比如本研究中的表皮毛基因)的回交育种中，仅需5年就可得到bc3f2，传统回交育种需8年(多3年的f1自交产生f2)，明显缩短育种年限，加快育种进程。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>西南大学<120>鉴定甘蓝表皮毛有无的分子标记及其开发方法和应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>587<212>dna<213>人工序列(1)<400>1aaacctctccaacaaagcccactctctctttctctctagatacaagatagtataataaaa60gagtttgccacctctcttctctgctctctcttcagtttctcatactttcctcttccacct120ccattgatggattcaacgtatcgacgtcagcgtcacaactctgaaggtccatctcatata180atgtgtttgattagcttattacatatgcatgctctttcttcataaccatattttatttcc240tttggacatagtcaatagtcatcgtgtttagctgaagttcatgttatcatatattatatt300tccctaattaaccagactcttcgtagccttaattatcacatatatgtagttacgcgattg360tgaataaacacaccaataacaaacttcgtagccttttattatatatatagccctaattgt420atttacgtgaatgtgaaataagtatttacgagcagagatgagatcaagaaggacatgaga480ttattacatacgtagcgattagcaaaagagaatataaaaatattggagcaaaaagtaaaa540gttttgtgttgtttttgataaatgcagaagtgtgtagcgtaaagtgg587<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(2)<400>2aaacctctccaacaaagccca21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(3)<400>3ccactttacgctacacacttc21当前第1页12