一株芽孢八叠球菌及其在畜禽粪便除臭中的应用的制作方法

本发明涉及功能微生物筛选
技术领域：
，具体涉及一种芽孢八叠球菌及其在畜禽粪便除臭中的应用。
背景技术：
：随着畜禽养殖业的规模化、集约化发展，环境污染问题愈发严重，管理难度加大。畜禽粪便堆放过程中会产生恶臭，导致环境恶化。畜禽粪便产生的臭气成分复杂，通常可以分为以下四大类：一是挥发性含硫化合物，如h2s、ch4s、硫醚类、等，主要来自微生物对硫酸盐的还原和含硫氨基酸的代谢作用；二是含氮化合物，如nh3、三甲胺等，主要来自微生物对蛋白质和氨基酸的脱氨作用；三是吲哚类和酚类，来源于微生物对苯丙氨酸、酪氨酸的分解；四是挥发性脂肪酸类，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，来源于氨基酸的脱氨和碳水化合物的分解。其中，nh3和h2s是臭味的主要组成成分，常用来表示畜禽舍的臭气含量。畜禽舍空气中的nh3是一种具有强烈刺激性臭味的无色气体，主要来自微生物对粪尿、饲料残渣和垫料等有机物中蛋白质和氨基酸的脱氨作用。一个年产10万头猪的猪场，每小时可向大气排放159kgnh3。据报道，在美国和欧洲超过80％的nh3产生和排放是来自于畜牧业。nh3可以引起眼和呼吸道疾病，并使畜禽抵抗力和免疫力降低，代谢强度减弱，生产能力下降，给畜禽生产造成严重经济损失的同时也威胁人类健康。就全球范围而言，来自畜牧业的nh3估计大约占50％以上。目前，国内外畜禽粪便恶臭治理主要有物理法、化学法和生物法三大类技术。物理除臭技术是利用吸附剂和掩蔽剂进行暂时性的吸附、掩盖臭味而达到除臭效果，存在成本高、吸附量有限等缺点。遮蔽法是用芳香味较强的物质如香草酸、胡椒醛、柴罗酮等掩蔽臭味，适用于水产、油脂、皮革和纤维加工等行业，不能从根本上除臭且成本高，应用有局限性。化学除臭技术是通过添加化学物质与恶臭物质发生反应而达到除臭目的，包括氧化法、中和法、杀菌法等。氧化法是利用强氧化剂将还原性恶臭物质氧化成无害无臭物质的过程，常用的氧化剂如臭氧、高铁酸盐等。中和法是在畜禽舍垫料上撒一层过磷酸钙，过磷酸钙与粪中产生的氨气发生反应，生成无味的固体磷酸铵盐，能减少粪便中氨气散发，降低氨气浓度。杀菌法是利用过氧化氢、高锰酸钾、硫酸铜、乙酸、苯甲酸等化学物质喷洒垫料，通过杀菌消毒，抑制有害细菌的活动，达到抑制和降低畜禽舍内有害气体的产生。化学法除臭效果好，但存在成本高、反应复杂、有二次污染、提高粪便资源化利用难度等缺点，难以推广应用。生物法除臭技术是上世纪50年代发展起来的技术，日本、德国、荷兰等国家取得了显著成果。生物法主要是利用微生物自身的代谢作用使恶臭成分降解为无臭、无害的终产物，如co2、h2o等，达到除臭目的。生物法除臭具有效率高、无二次污染、设备简单、运行成本低、管理维护方便等优点，已成为治理恶臭的主要技术发展方向之一。目前常用的菌种包括光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、芽孢杆菌、链霉菌、酵母菌、乳酸菌、米曲霉等。技术实现要素：本发明的目的是提供一株具有除臭功能的芽孢八叠球菌及其应用。本发明从黑水虻肠道中筛选得到一株芽孢八叠球菌(sporosarcinasp.)，降氨除臭效果明显，可有效降低鸡舍内的氨气等恶臭气体的浓度。本发明一方面提供了一株芽孢八叠球菌ly1(sporosarcinasp.ly1)，已于2018年11月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmccno.16759。所述菌株的16srdna如seqno.1所示。菌株ly1在分离培养基上菌落呈乳白色、近圆形、培养16h前菌落光滑湿润、24h后菌落表面干燥有褶皱、边缘不规则，易挑取；通过显微镜观察，呈卵圆形，排列以四联或堆状为主，革兰氏阳性，培养72h后观察芽孢着生在菌体侧端位置或游离存在，椭圆形。生理生化检测结果表明，菌株ly1的vp试验、氧化酶、触酶、脲酶、酯酶及磷酸酶试验阳性，甲基红、吲哚试验阴性，能同化多数糖醇，不能利用鼠李糖和山梨醇，5％nacl培养基中生长良好。将菌株ly1的16srdna进行pcr扩增测序，得到1449bp的16srdna序列，利用blast程序与genbank中已登录的基因序列进行比对，发现其与已知菌株sporosarcinapasteurii(kc211294)的相似性最高为97.59％，选取与其相似性高且已定名的菌株的相关序列信息，用clustalx1.83进行序列比对，用mega7.0中的neighbor-joining法构建系统发育树并采用bootstrap(重复抽样1000次)分析评估树的稳定性，可以看出菌株ly1和sporosarcinapasteurii的遗传进化距离较远。结合形态学、生理生化特性及16srdna基因序列的比对结果，初步将菌株ly1鉴定为芽孢八叠球菌属(sporosarcinasp.)，可能是一个潜在新种。本发明另一方面提供了一种微生物除臭剂，包含芽孢八叠球菌ly1。所述生物除臭剂还包含酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、光合细菌中的一种或两种及以上的组合。所述生物除臭剂的活菌量不低于108cfu/ml或109cfu/g，其中芽孢八叠球菌ly1的活菌量不低于总活菌量的70％。进一步，所述除臭剂为液体菌剂或固体粉剂。本发明还提供了上述生物除臭剂在畜禽粪便和餐厨垃圾中的应用，包括新鲜粪便、粪便堆肥过程、掺杂有畜禽粪便的垃圾或污水中的应用。本发明与现有技术相比的有益效果：本发明提供了一种新的芽孢八叠球菌：芽孢八叠球菌ly1(cgmccno.16759)，该菌株从黑水虻肠道中筛选得到，属于非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，不危害生态平衡，符合生物安全法规。芽孢八叠球菌ly1(cgmccno.16759)能够应用于畜禽粪便的生物除臭，能有效减少畜禽粪便中氨气、硫化氢等恶臭气体的释放量，从源头上减少恶臭气体的产生，且除臭效果稳定，受温度影响较小，在常温条件下仍具有较好的除臭效果。该菌既可以单独使用，也可以与其它菌如酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌等制成混合菌剂使用，使用时可原位处理也可异位处理，以0.1％～1.0％接种量直接喷洒菌液或菌粉于粪便中，因其能产生芽孢，抗逆性强，可以在粪便中良好生长，占据有利生态位，抑制产恶臭微生物生长繁殖，降低粪便恶臭气体释放量，喷洒1次，持续发挥除臭作用时间长达5天以上。该菌具有制备工艺简单高效、产品稳定可靠的特性，具有易形成商品化的明显的技术优势。附图说明图1为几株黑水虻肠道除臭菌的nh3脱除率。图2为菌株ly1的平板菌落形态。图3为菌株ly1基于16srrna序列的系统发育树。芽孢八叠球菌sporosarcinasp.于2018年11月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmccno.16759，保藏地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。具体实施方式下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。实施例1：芽孢八叠球菌ly1(cgmccno.16759)的分离鉴定采样：取20～30条黑水虻幼虫用酒精、生理盐水冲洗消毒后，解剖取肠道，在灭菌的研钵里进行研磨，加入适量无菌水，制成菌悬液。富集：用1ml移液管从研钵里取0.5ml菌悬液，分别接入(1)标注好的100ml液体富集培养基的摇瓶里，将摇瓶放进摇床以220转/min、30℃的条件，摇48小时(重复5次)；(2)标注好的200ml液体富集培养基的三角烧瓶中静置培养48小时。用1ml移液管，分别取1ml培养液进行稀释，并取10-3、10-4、10-5、10-6四个梯度，每个梯度做2个平行，摇瓶培养的涂布于固体富集培养基平板，静置培养的用固体培养基浇注，30℃培养48小时。从平板中取单菌落进行镜检，记录它们的形态并将不同性状的单菌落转接在斜面上，培养48小时，4℃保藏备用。1l富集培养基中的成分及其含量：glc10g，(nh4)2so42g，nacl1g，mgso4·7h2o1g，k2hpo4·2h2o1g，feso4’7h2o0.4g，母液1ml，母液(1l)：edta10g，znso41.2g，cacl21.5g，mgcl2·4h2o1g，feso4·h2o2g，(nh4)6mo2o24·4h2o1g，cuso4·5h2o1g，cocl2·6h2o1g。初筛：将所有分离得到的菌株，分别接种于相应的液体培养基中，放置于30℃、220r/min摇床上培养5d后，将培养物按5％接种量(10ml)分别接种到装有200g新鲜鸡粪的塑料盒中，用玻璃棒将培养液与鸡粪混合均匀，密封锥形瓶，30℃静止培养7d，通过感官法判断微生物的除臭效果，对照组为等量的无菌水，用感官划分臭味等级，按照不臭“m0"、微臭“m1”、较臭“m2”、很臭"m3"、恶臭“m4”划分为5个等级，并将除臭效果明显的菌株cy1、dy1、dy2、ly1、ly2进行复筛试验。复筛：称取200g新鲜鸡粪置塑料盒中，按5％接种量(10ml)接入培养好的初筛菌种，用玻璃棒充分混匀，同时以加等量无菌水作为空白对照，每个菌株设置3个平行。在塑料盒中放置一个50ml小烧杯，内装有20ml硼酸吸收液，用于吸收氨气。塑料盒封口，于30℃静置培养。利用酸碱滴定法测定氨气的释放量，每组重复试验3次。与空白对照组菌株进行差异显著性分析，计算氨气的去除率，如图1所示，筛选除臭效果最好的菌株ly1进行纯化培养和保藏。计算公式：去除率＝空白对照组与试验组释放量的差/空白对照组释放量×100％表1菌株ly1的生理生化特征注：+.阳性；-.阴性。菌株ly1的16srdna序列：ctgcgggtgctatacatgcagtcgagcgaatcaatgggagcttgctccctgagattagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgccctgcagatggggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatccggttcttcgcatgaagaaccgctgaaagacggtttcggctgtcactgcaggatgggcccgcggcgcattagctagttggtggggtaatggcctaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtgagggaagaacaagtacaggagtcactgtctgtaccttgacggtacctcaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtcctttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggaggacttgagtacagaagaggaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgctgcccggcatagagatatgcctttcccttcggggacagcggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacagagggctgcaaacccgcgagggggagccaatcccacaaaaccgttcccagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgtggatcagcatgccacggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaaccctacgggagccagccgccgaaggtgacaggat如图2所示，菌株ly1在分离培养基上菌落呈乳白色、近圆形、培养16h前菌落光滑湿润、24h后菌落表面干燥有褶皱、边缘不规则，易挑取；通过显微镜观察，呈卵圆形，排列以四联或堆状为主，革兰氏阳性，培养72h后观察芽孢着生在菌体侧端位置或游离存在，椭圆形。生理生化检测结果表明，菌株ly1的vp试验、氧化酶、触酶、脲酶、酯酶及磷酸酶试验阳性，甲基红、吲哚试验阴性，能同化多数糖醇，不能利用鼠李糖和山梨醇，5％nacl培养基中生长良好。综合上述试验结果，依据《常见细菌系统鉴定手册》，结合16srrna系统发育树，如图3所示，初步将菌株ly1鉴定为芽孢八叠球菌属(sporosarcinasp.)，它和已知菌株sporosarcinapasteurii(kc211294)的相似性最高为97.59％，但遗传进化距离较远，可能是一个潜在的新种。实施例2：芽孢八叠球菌ly1(cgmccno.16759)在鸡舍空气除臭中的应用效果液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏15g，nacl15g，蒸馏水1l，ph7.2，121℃灭菌20min。将芽孢八叠球菌ly1活化后以5％接种量接入液体培养基中，37℃、180rpm条件下培养18～24h，含菌量达到108cfu/ml，收集发酵菌液，平均分成2份，取其中1份加入酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌等制成混合菌剂，芽孢八叠球菌ly1含量60％，酵母菌10％，乳酸菌10％，芽孢杆菌10％，光合细菌10％，将上述2份菌液分别向2个同等养殖规模、同样管理条件下的鸡舍内均匀喷洒，在不同方位、离地高度1.5m左右，选取5个采样点，使用氨气检测仪器分别测定喷施前及喷施24h后鸡舍内氨气的浓度，并计算氨气的平均浓度，以无菌水作为对照组。结果见表2，喷施芽孢八叠球菌ly1或其混合菌液后，鸡舍内氨气浓度均显著降低，表明芽孢八叠球菌ly1对鸡舍空气的除臭效果明显。表2芽孢八叠球菌ly1对鸡舍空气的除臭效果测定指标(氨气浓度：ppm)对照芽孢八叠球菌ly1混合菌剂处理前187.3195.8169.0处理后89.216.513.5脱氨率％52.491.692.0实施例3：芽孢八叠球菌ly1(cgmccno.16759)在畜禽粪便和餐厨垃圾除臭中的应用培养基：蛋白胨10g，牛肉膏15g，nacl15g，蒸馏水1l，ph7.2，121℃灭菌20min。将芽孢八叠球菌ly1活化后在37℃、180rpm条件下培养18h，含菌量达到108cfu/ml，收集发酵菌液，分别接种5ml于装有500g鸡粪、猪粪、牛粪和餐厨垃圾的1l容积餐盒中，混拌均匀后用保鲜膜密封，对照组加5ml无菌水代替菌液，每组设置3个重复，室温放置5天后测定氨气浓度，结果如下表3。表3芽孢八叠球菌ly1对畜禽粪便的除臭效果测定指标(氨气浓度：ppm)鸡粪猪粪牛粪餐厨垃圾对照143.2136.1119.786.5处理组32.543.826.431.6脱氨率％77.367.877.963.5由表3可知，畜禽粪便中接种芽孢八叠球菌ly1处理5天后，鸡粪、猪粪、牛粪和餐厨垃圾产生的氨气浓度显著降低，表现出良好的除臭效果。序列表<110>鲁东大学<120>一株芽孢八叠球菌及其在畜禽粪便除臭中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1449<212>dna<213>芽孢八叠球菌ly1(sporosarcinasp.ly1)<400>1ctgcgggtgctatacatgcagtcgagcgaatcaatgggagcttgctccctgagattagcg60gcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgccctgcagatggggataactccgggaaac120cggggctaataccgaataatccggttcttcgcatgaagaaccgctgaaagacggtttcgg180ctgtcactgcaggatgggcccgcggcgcattagctagttggtggggtaatggcctaccaa240ggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcc300cagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggag360caacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtgagggaagaaca420agtacaggagtcactgtctgtaccttgacggtacctcaccagaaagccacggctaactac480gtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaa540gcgcgcgcaggcggtcctttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtc600attggaaactggaggacttgagtacagaagaggaaagcggaattccacgtgtagcggtga660aatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttctggtctgtaactgac720gctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgta780aacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagcaaacgcattaa840gcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggacccg900cacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttg960acatcccgctgcccggcatagagatatgcctttcccttcggggacagcggtgacaggtgg1020tgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaa1080cccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaac1140cggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgt1200gctacaatggacggtacagagggctgcaaacccgcgagggggagccaatcccacaaaacc1260gttcccagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatc1320gtggatcagcatgccacggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacacc1380acgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaaccctacgggagccagccgccgaagg1440tgacaggat1449当前第1页12