烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及烟草mlo2、mlo6和mlo12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，还涉及制备抗白粉菌烟草品种的方法。

背景技术：

白粉菌可以侵染超过650种的单子叶植物和9000多种双子叶植物，其危害影响极大，不仅对观赏类植物和水果产生了巨大的经济损失，也对许多农作物和经济作物带来了巨大的损失，严重影响了农业生产。目前，白粉病在我国各个地方均有发生，白粉病的危害呈现爆发范围大，侵染性广的特点。我国是当今世界上最大的烟草生产国，烟叶总产量和总销量都占有世界上30％左右。目前烟草税收已经占到我国财政收入的1/10，烟草已成为我国重要的经济植物。据不完全统计，我国每年烟草病害造成的直接经济损失在7亿元以上。而烟草白粉病(erysiphecichoracearumdc)是烟草生产上的主要病害之一，俗称“上硝”、“发白”或“下霜”。目前主要还是使用化学农药进行防治，而化学农药的使用，造成了烟叶中农药残留的增加，病害的抗药性增强和再猖獗，影响农业的可持续发展,并危及人类健康、破坏生态平衡。因此，通过选择和培育抗病的的品种是防治白粉病最安全和有效的方法。

目前在许多植物中，已经通过对mlo基因进行基因编辑或rnai等方法，获得了抗白粉病的植株。而mlo基因的发现，是在1942年fersileben和leni在大麦的突变体中发现了完全抗大麦白粉病blumeriagraminisf.sp.hordei(bgh)的植株，使得白粉病的防治获得了重大突破。他们利用x射线处理大麦品种haias，诱导其突变而产生了对bgh的广谱抗病性，该抗性基因在70年代被遗传学家命名为mildewresistancelocuso(mlo)。第一个野生大麦mlo基因在1997年被克隆，为mlo基因功能研究奠定了良好基础。隐性突变的mlo基因赋予了大麦对白粉病的广谱抗病性。在mlo基因功能的研究中，一般认为mlo基因在植物抗病过程中起负调控作用，类似于植物的“感病基因”，任何感病的野生型(mlo)都可以通过诱变获得对病原菌的广谱抗性。大麦mlo突变体发现已经超过70年，且25年前已经成功的应用于欧洲的农业生产，这表明在农业生产的条件下，mlo基因也表现出持久的抗病能力。目前，单子叶植物大麦和双子叶植物拟南芥都已获得到mlo突变体，它们均具有对白粉病菌的广谱抗性。不同的是，在大麦中mlo单基因的突变就可以表现出对白粉病的完全抗性，而在拟南芥中，共鉴定出15个mlo基因,其中与抗白粉病相关的的有atmlo2、atmlo6、atmlo12三个同源基因，这三个基因分别表现出对拟南芥白粉菌不同程度的抗性。atmlo2突变体表现出对白粉病的部分抗性，双突变体atmlo2与atmlo6和atmlo2与atmlo12对白粉病抗性增加，三突变体atmlo2、atmlo6和atmlo12表现出对白粉病的完全抗性。

烟草中也存在mlo基因家族，但是烟草mlo同源基因数量众多，哪些基因的功能与对白粉病的抗性相关，目前没有相关研究数据。故对烟草mlo基因进行精准定点失活进而获得抗白粉病烟草育种素材更是未见报道。因此通过基因编辑的方法，在烟草中对ntmlo基因进行敲除，制作抗白粉菌品种的烟草素材，对于烟草抗病育种和理论研究具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时敲低烟草mlo2、mlo6和mlo12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用；本发明的目的之二在于提供一种同时敲低烟草mlo2、mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna；本发明的目的之三在于提供含有所述多顺反子trna-sgrna的编辑失活载体；本发明的目的之四在于提供所述多顺反子trna-sgrna或所述编辑失活载体在制备抗白粉菌烟草品种中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备抗白粉病烟草品种的方法；本发明的目的之六在于提供由所述方法制得的抗白粉病烟草品种。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、同时敲低烟草mlo2、mlo6和mlo12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，所述mlo2的核苷酸序列如seqidno.7所示，所述mlo6的核苷酸序列如seqidno.8所示，所述mlo12的核苷酸序列如seqidno.9所示。

优选的，所述同时敲低烟草mlo2、mlo6和mlo12基因的方法是设计同时编辑mlo2,mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna。

优选的，所述同时编辑mlo2,mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna的靶序列如seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12所示。

优选的，所述同时编辑mlo2,mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna的核苷酸序列如seqidno.13所示。

2、一种同时敲低烟草mlo2、mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna，所述多顺反子trna-sgrna的核苷酸序列如seqidno.13所示。

3、含有权利要求5所述多顺反子trna-sgrna的编辑失活载体，所述编辑失活载体由多顺反子trna-sgrna连入pore-cas9载体bsai酶切位点处而得。

4、所述多顺反子trna-sgrna或所述编辑失活载体在制备抗白粉菌烟草品种中的应用。

5、一种制备抗白粉病烟草品种的方法，构建同时敲除mlo2,mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna，然后连入pore-cas9载体bsai酶切位点处获得编辑失活载体，转化烟草，筛选抗性芽，生根培养，获得t0代转基因植株，自交获得t1代转基因种子，将t1代转基因种子播种在卡那霉素抗性ms培养基中，获得t1代转基因植株，筛选基因敲除突变植株，即得抗白粉病烟草品种。

优选的，所述同时敲除mlo2,mlo6和mlo12基因的多顺反子trna-sgrna的核苷酸序列如seqidno.13所示。

6、由所述方法制得的抗白粉病烟草品种。

本发明的有益效果在于：本发明公开了同时敲低烟草mlo2、mlo6和mlo12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，通过构建含有mlo2、mlo6和mlo12三基因的多顺反子trna-grna，然后与载体骨架连接形成编辑失活载体，能够靶向编辑mlo2、mlo6和mlo12三基因失活，并且mlo2,mlo6和mlo12三基因同时编辑失活后，获得对白粉菌明显抗性的种质资源，对烟草抗白粉菌机制研究有重大意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑载体中trna-grna核心序列。

图2为mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑载体示意图。

图3为mlo2、mlo6和mlo12等3基因敲除株系突变位点分析。

图4为烟草mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑失活株系染病后叶片白粉菌的定量pcr检测(**p<0.01)。

图5为烟草mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑失活株系染病后叶片白粉菌的孢子量统计(**p<0.01)。

图6为mlo2、mlo6和mlo12等3基因敲除株系白粉病感染表型观察(a和a’表示野生型感染白粉病表型；b和b’表示敲除株系白粉病感染表型)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、烟草mlo2,mlo6,mlo12基因片段的获得

取烟草品种红花大金元的基因组dna为模板，设计克隆烟草mlo2，mlo6和mlo12基因的引物，具体引物如下：

ntmlo2-fragment-f：5'-cactgattgacgaaccttattg-3'(seqidno.1)；

ntmlo6-fragment-f：5'-tgaagagcttatgctacttggat-3'(seqidno.2)；

ntmlo12-fragment-f：5'-atggaggcaactccgact-3'(seqidno.3)；

ntmlo2-fragment-r：5'-gtcagcgcatttgtcagttc-3'(seqidno.4)；

ntmlo6-fragment-r：5'-gccaatgtggtaatacagtagaat-3'(seqidno.5)；

ntmlo12-fragment-r：5'-ctttggcacgcataagttag-3'(seqidno.6)；

然后以设计的引物进行pcr扩增，pcr扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，取5μlpcr产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并对所获片段进行序列测定。

扩增获得mlo2,mlo6和mlo12基因片段，具体序列分别如seqidno.7、seqidno.8和seqidno.9所示：

>ntmlo2(seqidno.7)

tcactgattgacgaaccttattgatttttctttacaactatcacaactctcaacttgattcaattaacaactaaacattattatcgatctttaatattcaaaattcatttaaacactatccattttgctaaaattatattataatcaatccttgataaatatgtatatatatattttaaaaaagatcactcgccgactaaacaccgaattaaaaacatttttccactgataaaaatctatgctcgttttctggttataatcttattatgattaattttgagcttacaattttcaagctaacatattgttatttttatttattttgaagagcttatgctactaggatttatatccctactgttaacagtagggcaagatccaatttcaaatatatgtgtatctgagaagattgcaagtacatggcatccatgtagtaagcaaaaagaagctgaaaagtacaacgtgcctgtagaggctgagggtcatcgccggcgacttcttacggcggctgacgacggtggagttcggcgaattttggcggctgtcggaactgacaaatgcgctgaca

>ntmlo6(seqidno.8)

tgaagagcttatgctacttggatttatatccctactgctaacagtagggcaagatccaatttcaaatatatgtgtatctgagaagattgcaagtacatggcatccatgtagtaagcaaaaagaagctgaaaagtacaacgtggctaaagaggctgagggtcatcgccggcgacttcttacggctgacgacggtggagttcggcgaagtttggcggctgtgggaactgacaaatgcgctgccaaggcatgtcacttttttttttgcccttttaaaaaaaaatcagttgaaaagaggaaaatttatttgtctgatctttcaatttaataatttcacttcacttatttaatttttaggagtagttaccagttatagttactcttttgaataaatcttattgtgtttaatagaagttaaactcgttaattatttaaactaagtggattattttttcttgttggatttgtttgcagggaaaagtagcatttgtgtctgctgatggtattcatcaattacatatcttcatttttgtgctggctatttttcacgtattctactgtattaccacattggct

>ntmlo12(seqidno.9)

atggaggcaactccgacttgggcagttgccgcagtttgcttcatcttgctggctatttccattttcattgaacaaattattcatcatcttggagaggtaggtagtaataacttaatttttgggagtttaattctagctagctagttttgtaaaatcagactgctaattaattcattgttcagattttactgctaatattactgcctaaaagggggtgaaaattttctagatcgatgaattggtattgcatgagatgtgtttgttttgttgatggagacttcatttatttggtttgcagtggttgttgaaaaaacataaaaagcctctttatgaagcacttgaaaagatcaaagcaggtaaaattaaagtagaattttcttaattttatatttgtatatcgtatatagttgaatgcatgtattgactgacattttaacgtaacagaactgatgttgttgggattcatatcactgctgttgacagtggtgcaaagcccagtgtctaacttatgcgtgccaaag

实施例2、mlo2,mlo6和mlo12三基因编辑靶标序列信息及基因编辑失活载体构建

在扩增出的mlo2基因片段序列(seqidno.7)中选择“tatccctactgttaacagta”(seqidno.10)、扩增出的mlo6基因片段序列(seqidno.8)中选择“caacgtggctaaagaggctg”(seqidno.11)、扩增出的mlo12基因片段序列(seqidno.9)中选择“cgcagtttgcttcatcttgc”(seqidno.12)作为拟编辑的靶位点。参考已发表的通过trna介导的多基因编辑的方法(kabinx,bastianm,yinongy(2015)."boostingcrispr/cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustrna-processingsystem."procnatlacadsciusa112:3570-3575)，合成mlo2，mlo6和mlo12三基因的多顺反子trna-grna，具体序列如seqidno.13和图1所示。用bsai酶切mlo2,mlo6和mlo12三基因的多顺反子trna-grna与pore-cas9载体(gao,j.,g.wang,s.ma,x.xie,x.wu,x.zhang,y.wu,p.zhaoandq.xia(2015)."crispr/cas9-mediatedtargetedmutagenesisinnicotianatabacum."plantmolbiol87(1-2):99-110.)，回收并且连接酶切产物，用plasmid-checkf和plasmid-checkrpcr检测、测序得到重组载体的阳性克隆质粒，命名为pore-cas9-mlo2mlo6mlo12editing，载体序列如seqidno.14所示(图2)。

plasmid-checkf：5’-ttaggtttacccgccaata-3’(seqidno.15)；

plasmid-checkr：5’-gagtagacaagtgtgtcgtgct-3’(seqidno.16)；

敲除载体质粒提取：用lb/kana的液体培养基扩大培养测序正确的菌液，参考全式金transgeneasypureplasmidminiprepkit(目录号：em101)提取敲除载体质粒，用于后续烟草叶片的遗传转化。

农杆菌制备：

1)用接种环从lba4404永久菌中沾取菌液，在yeb固体培养基(rif终浓度50mg/l，str终浓度50mg/l)上划线，置于28℃，倒置暗培养2-3天；

2)挑取农杆菌lba4404单菌落，接种于yeb液体培养基(rif终浓度50mg/l，str终浓度50mg/l)中，28℃，220rpm振荡培养过夜；

3)取1ml菌液接种于50mlyeb液体培养基(rif终浓度50mg/l，str终浓度50mg/l)中，28℃，220rpm振荡培养至od600＝0.5-0.6；

4)将菌液转移至50ml离心管中，冰浴30min，4℃、4000rpm离心15min，去上清，收集菌体；

5)用25ml预冷20mm的cacl2溶液轻轻悬浮菌体，冰浴20min，4℃、4000rpm离心15min，去上清，收集菌体；

6)加入2ml20mm的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞；

7)将感受态细胞分装于无菌的离心管，每管200μl，液氮速冻，-80℃保存。

实施例3、工程菌制备及转基因烟草制备

敲除载体转化农杆菌制备，具体步骤如下：

1)分别吸取≦1μg测序正确的pore-cas9-mlo2mlo6mlo12editing重组质粒加入到100μl农杆菌感受态细胞中(在感受态细胞刚刚溶解时加入)，轻弹混匀，冰浴30min；

2)液氮速冻1min后，立即于37℃水浴热击5min；

3)加入1mlyeb液体培养基，28℃、220rpm培养4-6h(出现絮状物)。

4)4000rpm离心3min，弃掉上清，加入新鲜yeb培养基200μl，用枪头吹打混匀，均匀涂布于yeb固体平板上(rif终浓度50mg/l，str终浓度50mg/l，kan终浓度50mg/l)，28℃，暗培养2-3天。

农杆菌阳性转化子筛选：分别以plasmid-checkf/r引物对农杆菌阳性转化菌进行菌液pcr鉴定。

叶盘法转化烟草：

1)农杆菌准备

将测序成功的敲除阳性农杆菌转化菌按照1：50的比例接种于50ml的yeb液体培养基(利福平、链霉素、卡那霉素的终浓度均为50mg/l)中，28℃、220rpm黑暗震荡培养25-36小时，待菌液od值达到0.5-0.6，使用50ml无菌离心管收集菌液，3500rpm，5℃离心15min，弃上清，用30mlms液体培养液(含有终浓度为100μmol/l的乙酰丁香酮)重悬菌体，28℃静置1-2小时。

2)叶盘预培养

以生长两个月红花大金元叶片组织为实验材料，用直径约0.5cm的打孔器获取植物叶盘，于预培养培养基ms1(ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba)上，28℃黑暗培养3天。

3)农杆菌浸染

将预培养3天的烟草叶盘侵染于重悬的农杆菌液体中，充分浸染10分钟，然后将叶盘置于灭菌的滤纸上，吸干表面的菌液，将叶盘置于ms1(ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba)培养基上，28℃黑暗培养3天。

4)抗性筛选

将共培养3天的烟草叶盘，用含有500mg/l的羧苄青霉素洗涤3-5次，再用滤纸吸干叶盘表面的水，将叶盘置于筛选培养基ms2(ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+250mg/l羧苄青霉素+50mg/l卡那霉素)上，28℃光照16小时，黑暗8小时筛选培养，10-15天更换一次培养基。

5)生根培养

待筛选培养的愈伤组织长出小芽1厘米左右时，将其剪下，转移至含卡那霉素的生根培养基ms上培养，待小芽生根并根系发育完全之后，洗去根部培养基，将植株置于自来水炼苗3-5天，直至长出新的根后，将植株移至土壤中，温室中生长。

6)t1代转基因植株获得

t0代转基因植株在温室中套袋自交收种子，获得t1代转基因种子，将其播种在卡那霉素抗性ms培养基中，获得t1代转基因植株，用于后续基因敲除的突变植株的筛选。

红花大金元t1代转基因敲除烟草的鉴定：提取t1代转基因幼苗的叶片基因组dna，pcr检测基因组中是否含有cas9基因序列，检测敲除载体是否已经插入转基因植株基因组中。cas9检测引物为cas9f:5’-cattgcgttgtcactcgg-3’(seqidno.17)，cas9r:5’-tgcgtagccattcttgga-3’(seqidno.18)。以t1代转基因幼苗叶片基因组dna为模板，分别扩增mlo2、mlo6和mlo12序列。pcr产物送测序公司测序，测序引物为扩增mlo2、mlo6和mlo12片段的上游引物。通过测序筛选基因敲除的突变体植株，检测靶位点处碱基的突变形式，鉴定得到烟草mlo2、mlo6和mlo12三基因同时突变植株，其中ntmlo2基因是一个碱基的缺失，ntmlo6基因这是两个碱基的缺失，而ntmlo12则是胸腺嘧啶(t)到胞嘧啶(c)的碱基替换(图3)。

实施例4、转基因烟草分析

1)红花大金元敲除植株的抗菌检测分析

(1)叶片菌含量的定量检测分析

菌含量检测分析参考已报道的方法(pfafflmw(2001)anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timert-pcr.nucleicacidsresearch29:e45)。白粉菌侵染七天后，分别取材等面积的野生型和突变株叶片，马上放入-80℃保存备用。分别提取野生型和突变株的基因组，使用g1-f5’ccaaagacccaacctaac3’(seqidno.19),g1-r5’cgatgccagagccaagag3’(seqidno.20)进行扩增定量检测菌含量。烟草ef-1a基因作为内参基因，ntef1a-f：5’gcattgcttgctttcaccctt3’(seqidno.21),ntef1a-r：5’aacctccttcacgatttcatcatacc3’(seqidno.22)。叶片中白粉菌的相对定量使用2^–△△ct的方法计算，结果如图4所示。结果显示，烟草mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑失活株系染病白粉菌基因表达量显著降低。

(2)叶片白粉菌孢子量计数

白粉菌侵染7天后，分别取材野生型和突变株叶片。放入无菌离心管内，加入2ml的无菌水，然后以最大转速离心3-5分钟，收集孢子。分别吸取10ul的菌液，加入到血球计数板上计数，结果使用三次的平均值，结果如图5所示。结果显示，烟草mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑失活株系染病白粉菌孢子量降低。

(3)宏观拍照观察

分别侵染7天后，对叶片进行拍照对比，结果如图6所示。结果显示，烟草mlo2、mlo6和mlo12三基因编辑失活株侵染7天后叶片未出现白粉菌感染现象。表明mlo2,mlo6和mlo12三基因同时编辑失活后，可获得对白粉菌明显抗性的种质资源，素材制备及抗白粉菌机制研究有重大意义。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>西南大学

<120>烟草mlo2、mlo6和mlo12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cactgattgacgaaccttattg22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgaagagcttatgctacttggat23

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atggaggcaactccgact18

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtcagcgcatttgtcagttc20

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gccaatgtggtaatacagtagaat24

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctttggcacgcataagttag20

<210>7

<211>568

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacum)

<400>7

tcactgattgacgaaccttattgatttttctttacaactatcacaactctcaacttgatt60

caattaacaactaaacattattatcgatctttaatattcaaaattcatttaaacactatc120

cattttgctaaaattatattataatcaatccttgataaatatgtatatatatattttaaa180

aaagatcactcgccgactaaacaccgaattaaaaacatttttccactgataaaaatctat240

gctcgttttctggttataatcttattatgattaattttgagcttacaattttcaagctaa300

catattgttatttttatttattttgaagagcttatgctactaggatttatatccctactg360

ttaacagtagggcaagatccaatttcaaatatatgtgtatctgagaagattgcaagtaca420

tggcatccatgtagtaagcaaaaagaagctgaaaagtacaacgtgcctgtagaggctgag480

ggtcatcgccggcgacttcttacggcggctgacgacggtggagttcggcgaattttggcg540

gctgtcggaactgacaaatgcgctgaca568

<210>8

<211>573

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacum)

<400>8

tgaagagcttatgctacttggatttatatccctactgctaacagtagggcaagatccaat60

ttcaaatatatgtgtatctgagaagattgcaagtacatggcatccatgtagtaagcaaaa120

agaagctgaaaagtacaacgtggctaaagaggctgagggtcatcgccggcgacttcttac180

ggctgacgacggtggagttcggcgaagtttggcggctgtgggaactgacaaatgcgctgc240

caaggcatgtcacttttttttttgcccttttaaaaaaaaatcagttgaaaagaggaaaat300

ttatttgtctgatctttcaatttaataatttcacttcacttatttaatttttaggagtag360

ttaccagttatagttactcttttgaataaatcttattgtgtttaatagaagttaaactcg420

ttaattatttaaactaagtggattattttttcttgttggatttgtttgcagggaaaagta480

gcatttgtgtctgctgatggtattcatcaattacatatcttcatttttgtgctggctatt540

tttcacgtattctactgtattaccacattggct573

<210>9

<211>521

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacum)

<400>9

atggaggcaactccgacttgggcagttgccgcagtttgcttcatcttgctggctatttcc60

attttcattgaacaaattattcatcatcttggagaggtaggtagtaataacttaattttt120

gggagtttaattctagctagctagttttgtaaaatcagactgctaattaattcattgttc180

agattttactgctaatattactgcctaaaagggggtgaaaattttctagatcgatgaatt240

ggtattgcatgagatgtgtttgttttgttgatggagacttcatttatttggtttgcagtg300

gttgttgaaaaaacataaaaagcctctttatgaagcacttgaaaagatcaaagcaggtaa360

aattaaagtagaattttcttaattttatatttgtatatcgtatatagttgaatgcatgta420

ttgactgacattttaacgtaacagaactgatgttgttgggattcatatcactgctgttga480

cagtggtgcaaagcccagtgtctaacttatgcgtgccaaag521

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tatccctactgttaacagta20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

caacgtggctaaagaggctg20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

cgcagtttgcttcatcttgc20

<210>13

<211>469

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

ggtctcagattgaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtac60

agacccgggttcgattcccggctggtgcagtatccctactgttaacagtagttttagagc120

tagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagt180

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