本发明涉及日化品的真菌杀灭效果评价方法，具体是一种应用atp荧光光度计对以杀菌率r或灭菌指数a表征的日化品真菌杀灭效果进行精准定量测试的atp生物荧光lgca-lgia标准曲线法，属于日化品杀菌效果评价技术领域。
背景技术：
近年来，伴随着人们生活水平提高和消费观念改变,国内市场对洗涤、洗护等日化用品需求量逐年递增；据中商产业研究院发布的《2018-2023年中国快消品行业发展前景及投资机会分析报告》显示，目前中国日化品消费市场整体呈现高于gdp增速的持续增长态势。截止2017年，国内日化行业规模为3233亿元，预计2018年将达3457亿元；受消费需求牵引，具备抗菌消毒功能的中高端日化产品市场年复合平均增长率在10％以上，预计2020年市场规模近1000亿。作为与民生息息相关的细分行业,中国日化用品产业现已进入竞争激烈的转型期；相关质检技术和检测效率逐渐提上日程。
目前，国内外抗菌消毒效果评价技术体系主要针对细菌和真菌，各国抗真菌效果测试方法原理多基于对白色念珠菌进行分离培养的平板计数法，鲜有涉及霉菌者；其中适用于白色念珠菌测试的一是日本工业标准提出的浸渍定量试验方法；二是源自美国纺织业的抑菌环法；三是国际通用的振荡烧瓶法；四是源于美国纺织企业的滴下法。虽然我国已颁布实施《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》、gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》和qb/t2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》等相关标准，但其规定的测试周期在48小时～72小时之间，时间及经济成本高。另外，多年来国际防霉效果评价技术体系基本源自美标、日标和欧标，所涉标准主要包括土埋培养法、琼脂平板法、湿室培养法等；由于霉菌孢子生长过程中形成的菌丝体无法准确计数，只能进行定性判定，无法定量测试；且因霉菌生长周期较长，培养时间至少2周～4周，导致测试周期较长，时间及经济成本高。无论针对白色念珠菌还是霉菌，现有标准方法的实验过程繁琐，技术难度较高；相关操作受人为因素影响大，使得测试误差大，缺乏可比性。近年来，在国际细菌检测技术领域atp荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比检测结果相关性为98％，准确度高且可实现快速检测。受需求牵引，国外抗菌材料性能检测技术研究领域针对当前定量化、快速化和简易化发展趋势，已借鉴atp荧光分析原理制定iso20743:2007-2013《textiles-determinationofantibacterialactivityoftextileproducts(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和iso13629-1:2012《textiles-determinationofantifungalactivityoftextileproducts.part1luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》规定了以样品接种后atp含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料；日化品细菌杀灭效果评估须针对中和效果评价、结果计算公式等关键技术方面形成一整套明确而具体的方法，同时需提供相关测量不确定度评估。另外，该标准方法抗菌性能表征参数较为单一，仅涉及抗菌活性值a，而我国则惯用杀灭率r。
因此，为规范国内市场秩序，促进产品更新换代，推动产业转型升级，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的日化产品真菌杀灭效果测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可填补国内外相关技术领域空白。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种应用atp荧光光度计对以杀菌率r或灭菌指数a表征的日化品真菌杀灭效果进行评价的atp生物荧光lgcb-lgib标准曲线法，能够解决日化品乃至其他领域抗菌产品真菌杀灭效果精准定量评价问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种日化品真菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及前处理要求；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量cb的血球板计数及接种菌液cb标定；(5)活菌含量对数值lgcb-相对荧光强度对数值lgib标准曲线建立；(6)中和剂鉴定及杀菌试验；(7)回收液相对荧光强度值ib测定；(8)回收液活菌含量cb和tb推算及杀菌率r和灭菌指数a计算；(9)结果评价；其特征在于，应用atp荧光光度计对以杀菌率r或灭菌指数a表征的日化品真菌杀灭效果进行精准定量评价的atp生物荧光lgcb-lgib标准曲线法，具体的：
在回收液相对荧光强度值ib测定中：
明确对照样品和试验样品的提取及前处理等要求，将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后采用血球计数板测定菌液的活菌含量cb，并对接种菌液cb进行标定：5.0×106cfu/ml～9.0×106cfu/ml。然后，选择活菌含量cb为1.4×103cfu/ml、1.4×104cfu/ml、1.4×105cfu/ml的菌液作为标准系列菌悬液，应用atp荧光光度计对其相对荧光强度值ib进行测定；绘制lgcb-lgib标准曲线，推导得出曲线的线性方程式y＝abx+bb及相关系数rb2。在中和剂鉴定结果合格的条件下，向4.7ml各组对照样品和试验样品中分别加入0.2ml菌液并混匀；待杀菌作用持续至规定时间后，用4.41ml中和剂溶液对0.49ml染菌样液进行中和回收，应用atp荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值ibcij和ibtij，并根据曲线方程式y＝abx+bb推算其活菌含量cbij和tbij；
在杀菌率r或灭菌指数a计算中：
根据试验菌种标准曲线lgcb-lgib的线性方程式y＝abx+bb，以特定杀菌时间内每件对照样品和试验样品回收液的相对荧光强度测定值
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定日化品真菌杀灭效果分级判定标准；当某组(件)日化样品的杀菌率ri(rij)或灭菌指数ai(aij)与其他两组(件)样品的真菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经atp生物荧光lgcb─lgib标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数。如果前后两组(件)日化样品的真菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率ri(rij)或灭菌指数ai(aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品真菌杀灭效果的评价结果。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，有益效果是：
(1)先进性：应用现代精密仪器—atp荧光光度计作为测试设备，能够精准快速测定日化品染菌特定时间后回收的活菌量，达到了日化品真菌杀灭效果评价的现代化；可有效降低实验过程中人为因素影响，突破了传统平皿培养法对霉菌的定性分析局限；实现了检测结果的定量化，并大幅提高检测数据准确性；检测技术具备一定的先进性。
(2)科学性：根据atp荧光分析法测试原理，建立了适用于多菌种的活菌含量对数值lgcb─相对荧光强度对数值lgib标准曲线；构建了日化品真菌杀灭效果评价atp生物荧光实时定量分析方法的数学模型。同时，兼顾不同国家消费者认知习惯，采取杀菌率r及灭菌指数a作为相关效果评价指标，提高了检测方法的科学性和通用性。
(3)创新性：与现行操作繁、周期长、非定量(霉菌)的传统方法相比，本专利方法在测试过程中引入自动化和智能化水平较高的atp荧光光度计，极大地简化了实验步骤，实现了日化品真菌杀灭效果评价的精准化和定量化并具备良好重现性和可比性；同时大幅缩短测试周期、降低检测成本；可有效填补目前相关测试技术领域空白。
(4)前瞻性：建立了以lgcb、lgib线性关系为基础的标准曲线定量分析方法，创新并丰富了白色念珠菌和霉菌孢子悬液活菌含量测定方法，明确了对照样品、标液浓度、测定步骤、计算公式、不确定度等技术内容；首创以仪器直接测得的回收液活菌相对荧光强度值ib作为结果评价形式来计算并判定杀菌率r及灭菌指数a，并通过组内及组间变异系数c·v考察测量不确定度，在技术上具有一定的前瞻性。
(5)可操作性：atp荧光光度计价格低廉、操作简单、应用广泛，本专利建立的美蓝染色后血球板活菌计数法和日化品真菌杀灭效果评价的atp荧光测试方法简便易行，相关技术说明清晰而具体，易于理解和掌握；在实施过程中具备较强的可操作性，适用于不同专业水平的微生物实验人员，有利于促进成果转移转化和推广应用。
(6)普适性：因atp普遍存在于生命体细胞内，专利方法可为实验菌种扩增提供具有广谱价值的检测技术支撑；相关仪器的引入可极大简化实验步骤，降低测试成本；有利于扩大在检、学、研、产各界推广应用，能够支撑日化品真菌杀灭效果评价技术实现普适化，同时可对消毒剂、卫生用品等领域杀菌效果评价技术研究提供参考借鉴。
进一步的，本发明的优选方案是：
所述的样品提取及前处理要求，按下述步骤进行：
(1)对照样品：以察氏培养液作为对照样品，其用量、数量及标准硬水稀释操作等与待测试验样品相同；
(2)试验样品：具有特殊卫生功效的洗涤用品、洁肤用品等日化产品；每个菌种杀菌效果试验使用3组取自同一生产批号不同运输包装的样品,每组样品分别取自同一运输包装中的3件最小销售包装(样品量不少于10g)；中和剂鉴定试验需用3件同一运输包装的最小销售包装样品(样品量不少于10g)。试验前用无菌标准硬水将对照样品和试验样品分别稀释至产品说明书规定浓度的2倍，未明示的浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品作用浓度分别为1:100和1:5；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、漂渍液、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用浓度为1:100；直接喷洒型硬表面清洁用品使用原液，浓缩型样品作用浓度为1:100。每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；
所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：
(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合gb/t6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；
(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含atp荧光光度计、专用试管等的atp生物荧光快速检测系统，atp荧光光度计波长量程300nm～650nm，真菌细胞/孢子总数检测范围101cfu/ml～106cfu/ml；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kpa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)khz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的ph计；电炉；
(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1ml、10ml的无菌刻度吸管；0.05ml、0.1ml、0.2ml、1ml、5ml、10ml(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100ml、250ml、500ml的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；
(4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；n一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将0.034g氯化钙、0.139g氯化镁溶于1000ml水中，配制成硬度为342mg/l的标准硬水；将5g硫代硫酸钠溶于1000ml水(用于含氯型杀菌剂样品)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000ml水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000ml水(用于含非氧化型杀菌剂样品)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000ml磷酸盐缓冲溶液(用于含氧型杀菌剂样品)等(或针对待测日化样品所含杀菌剂类型，选择其他相适用的中和剂)；
(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000ml水中(培养液不加琼脂)，调节ph至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000ml含0.05％润湿剂的水溶液中，调节ph至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000ml水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000ml；
(6)atp荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配atp荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/l且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节ph至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
atp荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250ml水中，调节ph至7.5±0.2；8h内使用；
atp裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(ec:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(ec:3.5.4.6或ec:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10ml浓度为0.05mol/l的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节ph至6.0±0.5，8h内使用(1ml裂解液在15min内可将沙氏培养液中的atp浓度降至10-11mol/l以下)；
atp提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节ph至12.0±0.5(真菌细胞atp提取效率不低于80％)；
atp荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的d-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30ml的atp荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用；
所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：
(1)试验菌种：白色念珠菌atcc10231；黑曲霉atcc16404；球毛壳霉atcc6205；产黄青霉atcc9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；
(2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5ml～10ml沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h。霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌；
(3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用。霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；
(4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50ml沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用。霉菌试验——向菌种试管中加入10ml的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45ml察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50ml察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用；
所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量cb血球板计数及接种菌液cb标定，按下述步骤进行：
(1)美蓝染色：以无菌操作将50μl稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μl浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀；
(2)血球板计数：用无菌吸管将5μl±0.5μl染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作。用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内。当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子；
(3)活菌含量cb计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子。若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液。对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值。当血球计数板规格为16×25时，1ml菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，cfu/ml)cb＝n÷5×16×k×104；当血球计数板规格为25×16时，cb＝n÷5×25×k×104；其中n为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，k为菌液稀释倍数。然后，用察氏培养液对已知活菌含量cb的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液进行稀释，得到cb范围为5.0×106cfu/ml～9.0×106cfu/ml的接种菌液；
所述的活菌含量对数值lgcb-相对荧光强度对数值lgib标准曲线建立，按下述步骤进行：
用察氏培养液对已知活菌含量cb的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液进行连续梯度稀释后，得到标准系列菌悬液：1.4×103cfu/ml、1.4×104cfu/ml、1.4×105cfu/ml并混匀。根据本专利中相对荧光强度值ib测定方法，按照活菌含量cb从低到高的顺序，测定并记录上述标准溶液的相对荧光强度值。然后，以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgib作为横坐标，以相应的活菌含量对数值lgcb为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，应用最小二乘拟合法推导得出曲线方程式y＝abx+bb及线性相关系数rb2；当rb2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效；
所述的中和剂鉴定及杀菌试验，按下述步骤进行：
(1)中和剂鉴定试验：先将1ml试验样品与9ml中和剂溶液混合，作用10min形成中和产物溶液；并对试验分组如下：用灭菌移液枪将0.2ml接种菌液(与lgcb-lgib曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)分装六支含4.7ml试验样品(1#、2#)、4.7ml中和剂溶液(3#、7#)、4.7ml中和产物溶液(4#)、4.7ml察氏培养液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使各组溶液充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.49ml各组混匀液分装六支含4.41ml察氏培养液(1#、5#、7#)、4.41ml中和剂溶液(2#、3#)、4.41ml中和产物溶液(4#)的无菌试管中，并将2.45ml察氏培养液与2.45ml中和剂溶液加入同一支无菌试管中，作为第6#组试验样液。1000r/min振摇各组试管10min后将其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值ib测定方法，测定并记录上述7组回收液的相对荧光强度值；同时将第7#组回收液的测定值记为ib0；
(2)中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值ib1≥0、ib6＝0，第2#～5#组回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：ib2≥0且ib2＜ib3、ib2＜ib4、ib2＜ib5；第3#、4#、5#组与第7#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即ib3≈ib4≈ib5≈ib0，其按照公式(1)计算得到的活菌含量cb3、cb4、cb5组间误差率δ≤10％；说明所选中和剂种类及浓度可用于待测日化样品的真菌杀灭效果试验。
式中：
δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌含量cb3、cb4、cb5组间误差率，％；
ib3、ib4、ib5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，rlu；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率；bb—标准曲线lgcb-lgib在纵轴截距。
(3)杀菌试验：用灭菌移液枪将每组4.7ml对照样品和试验样品分装无菌试管中，在(20±1)℃恒温水浴中(皂类样品30℃)保温(5±0.5)min后，向试管内滴加0.2ml接种菌液，迅速混匀并按照产品说明书标注的作用时间开始计时。未明示时间的硬表面清洁用品(直接喷洒型及浓缩型)作用5min；浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品分别作用15min和5min；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用20min(漂渍液作用5min)。待杀菌作用持续至规定时间后，用灭菌移液枪移取0.49ml各组染菌混匀液，分装含4.41ml灭菌中和剂溶液的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，充分中和后将其作为待测样品的回收液；
所述的回收液相对荧光强度值ib测定，按下述步骤进行：
(1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1ml察氏培养液、0.35ml生理盐水和0.05ml的atp裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min，作为一级空白样；再将0.1ml一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4ml生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1ml二级空白样依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中各滴加0.1ml的atp提取试剂，混匀后滴入0.1ml的atp荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用atp荧光光度计测定其相对荧光强度值ib并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)；
(2)回收液相对荧光强度值ib测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9ml回收液和0.1ml的atp裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，滴加5.0ml的atp提取试剂并再次混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1ml上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为atp生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1ml的atp荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用atp荧光光度计测定其相对荧光强度值ib并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个atp生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的ib测定值；
所述的回收液活菌含量cb和tb推算以及杀菌率r和灭菌指数a计算，按下述步骤进行：
(1)回收液活菌含量cb和tb推算
根据试验菌种标准曲线lgcb-lgib的线性方程式y＝abx+bb，推算对照样品和试验样品经染/杀菌特定时间后回收液的活菌含量cb和tb。相关计算见公式(2)～(7)：
式中：
cb—3组对照样品染菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；
cbi—每组对照样品染菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；
cbij—每件对照样品染菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率；bb—标准曲线lgcb-lgib在纵轴截距；
tb—3组试验样品杀菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；
tbi—每组试验样品杀菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；
tbij—每件试验样品杀菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
(2)杀菌率r计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的杀菌率rij、每组及每批样品的杀菌率ri和r分别按照公式(8)、(9)、(10)计算：
式中：
rij—每件日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ri—每组日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
r—每批日化样品的杀菌率，％；
cbij—每件对照样品染菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
tbij—每件试验样品杀菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率；
(3)灭菌指数a计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的灭菌指数aij、每组及每批样品的灭菌指数ai和a分别按照公式(11)、(12)、(13)计算:
式中：
aij—每件日化样品的灭菌指数；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ai—每组日化样品的灭菌指数，样品组别i＝1,2,3；
a—每批日化样品的灭菌指数；
cbij—每件对照样品染菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
tbij—每件试验样品杀菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率；
(4)数据修约要求：采用血球计数板标定菌悬液的活菌含量cb时，参考gb4789.2—2016相关规定，当cb小于100cfu/ml时，“四舍五入”取整数；当cb不小于100cfu/ml时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值
(5)测量不确定度：本专利方法通过计算对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数c·v＝σ÷μ×100％(μ、σ和c·v计算结果保留到小数点后两位)，判断将atp生物荧光分析法应用于日化品真菌杀灭效果测试的重现性；规定组内及组间变异系数c·v≤10％。相关计算见公式(14)～(16)：
式中：
μci—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
μti—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
μc—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
μt—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σci—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σti—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σc—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σt—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
所述的日化样品真菌杀灭效果的结果评价，按下述步骤进行：
(1)参考卫生行业通用做法和相关杀菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用杀菌率r作为相关性能评价指标：当rij/ri/r＜80％时，样品无真菌杀灭作用；当80％≤rij/ri/r＜90％时，样品具有真菌杀灭作用；当90％≤rij/ri/r＜99％时，样品真菌杀灭作用适中；当99％≤rij/ri/r＜99.9％时，样品真菌杀灭作用较强；当rij/ri/r≥99.9％时，样品真菌杀灭作用极强；
如果采用灭菌指数a作为相关性能评价指标：当aij/ai/a＜0.5时，样品无真菌杀灭作用；当0.5≤aij/ai/a＜1.0时，样品具有真菌杀灭作用；当1.0≤aij/ai/a＜2.0时，样品真菌杀灭作用适中；当2.0≤aij/ai/a＜3.0时，样品真菌杀灭作用较强；当aij/ai/a≥3.0时，样品真菌杀灭作用极强；
(2)当某组(件)日化样品的杀菌率ri(rij)或灭菌指数ai(aij)与其他两组(件)样品的真菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经atp生物荧光lgcb─lgib标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数。如果前后两组(件)日化样品的真菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率ri(rij)或灭菌指数ai(aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品真菌杀灭效果评价结果；
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本实施例以由三氯卡灵作为抗菌剂加工而成的强效漂渍液样品真菌杀灭效果评价为例进行说明。
具体的检测方法按下述步骤进行：
(1)样品提取及前处理要求
1.1对照样品：以察氏培养液作为对照样品，其用量、数量及标准硬水稀释操作等与待测试验样品相同。
1.2试验样品：具有特殊卫生功效的洗涤用品、洁肤用品等日化产品；每个菌种杀菌效果试验使用3组取自同一生产批号不同运输包装的样品,每组样品分别取自同一运输包装中的3件最小销售包装(样品量不少于10g)；中和剂鉴定试验需用3件同一运输包装的最小销售包装样品(样品量不少于10g)。试验前用无菌标准硬水将对照样品和试验样品分别稀释至产品说明书规定浓度的2倍，未明示的浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品作用浓度分别为1:100和1:5；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、漂渍液、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用浓度为1:100；直接喷洒型硬表面清洁用品使用原液，浓缩型样品作用浓度为1:100。每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识。
(2)设备选型及试剂、培养基配制
2.1通用要求：试验用分析纯试剂及符合gb/t6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验。
2.2仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含atp荧光光度计、专用试管等的atp生物荧光快速检测系统，atp荧光光度计波长量程300nm～650nm，真菌细胞/孢子总数检测范围101cfu/ml～106cfu/ml；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kpa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)khz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的ph计；电炉。
2.3材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1ml、10ml的无菌刻度吸管；0.05ml、0.1ml、0.2ml、1ml、5ml、10ml(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100ml、250ml、500ml的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；
2.4试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；n一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将0.034g氯化钙、0.139g氯化镁溶于1000ml水中，配制成硬度为342mg/l的标准硬水；将5g硫代硫酸钠溶于1000ml水(用于含氯型杀菌剂样品)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000ml水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000ml水(用于含非氧化型杀菌剂样品)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000ml磷酸盐缓冲溶液(用于含氧型杀菌剂样品)等(或针对待测日化样品所含杀菌剂类型，选择其他相适用的中和剂)。
2.5培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；
沙氏培养基/液(白色念珠菌菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000ml水中(培养液不加琼脂)，调节ph至5.6±0.2(25℃)；
察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000ml含0.05％润湿剂的水溶液中，调节ph至6.0～6.5(25℃)；
马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000ml水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000ml。
2.6atp荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配atp荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；
稀释缓冲溶液：0.005mol/l且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节ph至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；
atp荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250ml水中，调节ph至7.5±0.2；8h内使用；
atp裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(ec:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(ec:3.5.4.6或ec:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10ml浓度为0.05mol/l的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节ph至6.0±0.5，8h内使用(1ml裂解液在15min内可将沙氏培养液中的atp浓度降至10-11mol/l以下)；
atp提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节ph至12.0±0.5(真菌细胞atp提取效率不低于80％)；
atp荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的d-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30ml的atp荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。
(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备
3.1试验菌种：白色念珠菌atcc10231；黑曲霉atcc16404；球毛壳霉atcc6205；产黄青霉atcc9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)。
3.2菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5ml～10ml沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h。霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌。
3.3菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用。霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子。制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液。
3.4菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50ml沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用。霉菌试验——向菌种试管中加入10ml的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45ml察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液。然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50ml察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物。每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用。
(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量cb血球板计数及接种菌液cb标定
4.1美蓝染色：以无菌操作将50μl稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μl浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀。
4.2血球板计数：用无菌吸管将5μl±0.5μl染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作。用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内。当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子。
4.3活菌含量cb计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子。若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液。对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值。当血球计数板规格为16×25时，1ml菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，cfu/ml)cb＝n÷5×16×k×104；当血球计数板规格为25×16时，cb＝n÷5×25×k×104；其中n为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，k为菌液稀释倍数。然后，用察氏培养液对已知活菌含量cb的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液进行稀释，得到cb范围为5.0×106cfu/ml～9.0×106cfu/ml的接种菌液。
(5)活菌含量对数值lgcb-相对荧光强度对数值lgib标准曲线建立
用察氏培养液对已知活菌含量cb的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液进行连续梯度稀释后，得到标准系列菌悬液：1.4×103cfu/ml、1.4×104cfu/ml、1.4×105cfu/ml并混匀。根据本专利中相对荧光强度值ib测定方法，按照活菌含量cb从低到高的顺序，测定并记录上述标准溶液的相对荧光强度值。然后，以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgib作为横坐标，以相应的活菌含量对数值lgcb为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，应用最小二乘拟合法推导得出曲线方程式y＝abx+bb及线性相关系数rb2；当rb2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效。
(6)中和剂鉴定及杀菌试验
6.1中和剂鉴定试验：先将1ml试验样品与9ml中和剂溶液混合，作用10min形成中和产物溶液；并对试验分组如下：用灭菌移液枪将0.2ml接种菌液(与lgcb-lgib曲线标定用菌液取自同一支试验菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)分装六支含4.7ml试验样品(1#、2#)、4.7ml中和剂溶液(3#、7#)、4.7ml中和产物溶液(4#)、4.7ml察氏培养液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使各组溶液充分混匀。然后，用灭菌移液枪将0.49ml各组混匀液分装六支含4.41ml察氏培养液(1#、5#、7#)、4.41ml中和剂溶液(2#、3#)、4.41ml中和产物溶液(4#)的无菌试管中，并将2.45ml察氏培养液与2.45ml中和剂溶液加入同一支无菌试管中，作为第6#组试验样液。1000r/min振摇各组试管10min后将其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值ib测定方法，测定并记录上述7组回收液的相对荧光强度值；同时将第7#组回收液的测定值记为ib0。
6.2中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值ib1≥0、ib6＝0，第2#～5#组回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：ib2≥0且ib2＜ib3、ib2＜ib4、ib2＜ib5；第3#、4#、5#组与第7#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即ib3≈ib4≈ib5≈ib0，其按照公式(1)计算得到的活菌含量cb3、cb4、cb5组间误差率δ≤10％；说明所选中和剂种类及浓度可用于待测日化样品的真菌杀灭效果试验。
式中：
δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌含量cb3、cb4、cb5组间误差率，％；
ib3、ib4、ib5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，rlu；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率；bb—标准曲线lgcb-lgib在纵轴截距。
6.3杀菌试验：用灭菌移液枪将每组4.7ml对照样品和试验样品分装无菌试管中，在(20±1)℃恒温水浴中(皂类样品30℃)保温(5±0.5)min后，向试管内滴加0.2ml接种菌液，迅速混匀并按照产品说明书标注的作用时间开始计时。未明示时间的硬表面清洁用品(直接喷洒型及浓缩型)作用5min；浸泡型和涂抹型果蔬、餐饮具洗涤用品分别作用15min和5min；洗衣液、洗衣粉、衣物柔顺剂、地毯清洗剂等织物类洗涤护理用品作用20min(漂渍液作用5min)。待杀菌作用持续至规定时间后，用灭菌移液枪移取0.49ml各组染菌混匀液，分装含4.41ml灭菌中和剂溶液的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，充分中和后将其作为待测样品的回收液。
(7)回收液相对荧光强度值ib测定
7.1仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1ml察氏培养液、0.35ml生理盐水和0.05ml的atp裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min，作为一级空白样；再将0.1ml一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4ml生理盐水并混匀，作为二级空白样。然后，用灭菌移液枪将0.1ml二级空白样依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中各滴加0.1ml的atp提取试剂，混匀后滴入0.1ml的atp荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用atp荧光光度计测定其相对荧光强度值ib并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)。
7.2回收液相对荧光强度值ib测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9ml回收液和0.1ml的atp裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，滴加5.0ml的atp提取试剂并再次混匀；室温静置10min。用灭菌移液枪将0.1ml上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为atp生物荧光测试平行样。向三个平行样中各滴加0.1ml的atp荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用atp荧光光度计测定其相对荧光强度值ib并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)。每个平行样测定时间不超过15s，以三个atp生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的ib测定值。
(8)回收液活菌含量cb和tb推算以及杀菌率r和灭菌指数a计算
8.1回收液活菌含量cb和tb推算
根据试验菌种标准曲线lgcb-lgib的线性方程式y＝abx+bb，推算对照样品和试验样品经染/杀菌特定时间后回收液的活菌含量cb和tb。相关计算见公式(2)～(7)：
式中：
cb—3组对照样品染菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；
cbi—每组对照样品染菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；
cbij—每件对照样品染菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率；bb—标准曲线lgcb-lgib在纵轴截距；
tb—3组试验样品杀菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；
tbi—每组试验样品杀菌特定时间后回收的平均活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；
tbij—每件试验样品杀菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
8.2杀菌率r计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的杀菌率rij、每组及每批样品的杀菌率ri和r分别按照公式(8)、(9)、(10)计算：
式中：
rij—每件日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ri—每组日化样品的杀菌率，％；样品组别i＝1,2,3；
r—每批日化样品的杀菌率，％；
cbij—每件对照样品染菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
tbij—每件试验样品杀菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率。
8.3灭菌指数a计算
在中和剂鉴定结果合格的条件下，每件日化样品的灭菌指数aij、每组及每批样品的灭菌指数ai和a分别按照公式(11)、(12)、(13)计算:
式中：
aij—每件日化样品的灭菌指数；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ai—每组日化样品的灭菌指数，样品组别i＝1,2,3；
a—每批日化样品的灭菌指数；
cbij—每件对照样品染菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
tbij—每件试验样品杀菌特定时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(cfu/ml)；样品组别i＝1,2,3；每组样品编号j＝1,2,3；
ab—标准曲线lgcb-lgib斜率。
8.4数据修约要求：采用血球计数板标定菌悬液的活菌含量cb时，参考gb4789.2—2016相关规定，当cb小于100cfu/ml时，“四舍五入”取整数；当cb不小于100cfu/ml时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字。对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后，回收液的相对荧光强度测定值
8.5测量不确定度：本专利方法通过计算对照样品和试验样品经染/灭菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值的组内及组间变异系数c·v＝σ÷μ×100％(μ、σ和c·v计算结果保留到小数点后两位)，判断将atp生物荧光分析法应用于日化品真菌杀灭效果测试的重现性；规定组内及组间变异系数c·v≤10％。相关计算见公式(14)～(16)：
式中：
μci—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
μti—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
μc—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
μt—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σci—每组3件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σti—每组3件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σc—3组9件对照样品染菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
σt—3组9件试验样品杀菌特定时间后，回收液相对荧光强度测定值
(9)结果评价
9.1参考卫生行业通用做法和相关杀菌产品标准要求，采取以下分级判定标准：
如果采用杀菌率r作为相关性能评价指标：当rij/ri/r＜80％时，样品无真菌杀灭作用；当80％≤rij/ri/r＜90％时，样品具有真菌杀灭作用；当90％≤rij/ri/r＜99％时，样品真菌杀灭作用适中；当99％≤rij/ri/r＜99.9％时，样品真菌杀灭作用较强；当rij/ri/r≥99.9％时，样品真菌杀灭作用极强；
如果采用灭菌指数a作为相关性能评价指标：当aij/ai/a＜0.5时，样品无真菌杀灭作用；当0.5≤aij/ai/a＜1.0时，样品具有真菌杀灭作用；当1.0≤aij/ai/a＜2.0时，样品真菌杀灭作用适中；当2.0≤aij/ai/a＜3.0时，样品真菌杀灭作用较强；当aij/ai/a≥3.0时，样品真菌杀灭作用极强。
9.2当某组(件)日化样品的杀菌率ri(rij)或灭菌指数ai(aij)与其他两组(件)样品的真菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组样品重复实验；计算其经atp生物荧光lgcb─lgib标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数。如果前后两组(件)日化样品的真菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率ri(rij)或灭菌指数ai(aij)的算术平均值作为该批次(组)日化样品真菌杀灭效果评价结果。
本实施例所用检测资质、仪器设备和试验器材、培养基/液、化学试剂、标准菌株：
(1)试验设施
在机构注册号为cnasbl0059的二级生物安全实验室内，由具有副高级技术职称的微生物检测专业人员完成相关实验。
(2)仪器设备和试验器材
2.1二级生物安全柜：thermoscientific1300系列二级b2型生物安全柜，工作台表面积0.55m2，排气量1130m3/h，过滤效率99.99％(0.3μm)；
2.2超净工作台：美国品牌thermoscientifictmheraguardtm、型号eco的超净工作台，内部宽×深×高＝920mm×585mm×645mm；空气流速为0.15m/s～0.25m/s和0.36m/s～0.45m/s。
2.3atp生物荧光快速检测系统：美国hygiena公司的便携式systemsureatp荧光检测仪，含配套试剂盒、塑料专用试管等；atp含量检测下限4×10-18mol/ml、微生物总量检出限1.0cfu/ml，rlu读数范围0～9999，检测时间10s，采样速率1000次/s，测量误差±5％；
2.4生物光学显微镜：具备10倍宽视场可调目镜以及4倍、10倍、20倍、40倍和100倍平场消色差物镜的奥林巴斯bx43三目研究级生物显微镜；
2.5恒温恒湿培养箱：冠森生物科技(上海)有限公司型号ws-380h、容积380l、控温范围(0～50)℃±0.8℃、控湿范围(30～95)％rh±2％rh的恒温恒湿培养箱；
2.6恒温振荡器：上海一恒型号ws-380h、控温范围(4～65)℃±0.1℃、振荡频率(40～300)r/min、定时范围(1～99)h。
2.7冷冻离心机：北京新诺立华仪器有限公司型号dl7m-12l的立式冷冻离心机，转速8000r/min±20r/min，相对离心力12300×g；容量14400ml，定时范围1s～99h59min99s，控温范围(-20～40)℃±1℃，离心管规格ф74mm×168mm。
2.8恒温水浴箱：上海基玮试验仪器设备有限公司型号dk-s420的电热恒温水槽，容积15l，控温范围(5～99.9)℃±0.5℃，定时范围1min～999min。
2.9压力蒸汽灭菌器：日本sanyo公司型号mls-3780高压灭菌器，容积75l，灭菌温度(105～135)℃±2℃，最大压力0.235mpa，定时器(1～250)min。
2.10低温冰箱：中科美菱低温科技股份有限公司型号dw-hl398的超低温冷冻储存箱，有效容积398l，存储温度-10℃～-86℃。
2.11冰箱：东莞市昊欣仪器设备有限公司型号hxl-25-250ad的低温箱超低温冰箱，其冷藏箱(2～10)℃±0.1℃，冷冻箱(-30～20)℃±0.1℃。
2.12电子天平：日本岛津型号aux220的电子天平，量程220g，精度±0.1mg。
2.13超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司型号yq-120c的超声波清洗机，容量3.2l，超声频率40khz/28khz/25khz，定时范围1min～30min/99min。
2.14旋涡振荡器：美国品牌coleparmervotex-genie2的旋涡振荡器，转速范围(500～3000)r/min±3r/min，定时范围1s～60s。
2.15ph计：上海精密仪器仪表有限公司型号mp512-03的精密ph计，量程范围(-2.000～19.999)ph±0.002ph，温度范围(-10～110)℃±0.4℃。
2.16电炉：常州德科仪器有限公司型号dld-1kw的1kw封闭式调温电炉。
2.17血球计数板：上海求精规格为25×16的血球计数板。
(3)培养基/液
北京陆桥技术股份有限公司生产的培养基/液。
(4)化学试剂
4.10.1％的吕氏碱性美蓝染色液：购自上海心语生物科技有限公司。
4.2三磷酸腺苷二钠标准品及配制atp荧光试剂缓冲溶液、atp裂解液、atp提取液和atp荧光试剂所需一系列生化试剂购自上海金畔生物科技有限公司代理的美国amresco品牌。
(5)标准菌株
白色念珠菌atcc10231购自中国医学真菌保藏管理中心；黑曲霉atcc16404；球毛壳霉atcc6205；产黄青霉atcc9179购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本实施例的检测数据及结果计算：
应用atp荧光光度计经lgcb-lgib标准曲线法对抗菌漂渍液样品的真菌杀灭效果进行评价，作用浓度为1:100，作用时间为5min；选择5g/l硫代硫酸钠溶液作为中和剂，可有效中和待测漂渍液样品对试验菌种的残留作用。相关中和剂鉴定、杀菌试验数据和杀菌效果评价及测量不确定度计算结果分别见表1～表3。
表1中和剂鉴定试验数据及组间误差率计算结果
表2杀菌试验数据及杀菌率r、灭菌指数a计算结果
表3相对荧光强度值测量不确定度计算结果
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。