一株高产茶氨酸的茶树内生菌CsE7及其应用的制作方法

本发明属于茶氨酸的制备技术领域，具体涉及一株高产茶氨酸的茶树内生菌cse7及其应用。

背景技术：

茶氨酸(l-theanine)，是n-乙基-γ-谷氨酰胺，占茶叶中氨基酸总量的70％以上，是茶树中特有的非蛋白质游离氨基酸，也是赋予茶叶特殊风味的主要物质，其含量直接决定茶叶品质。茶氨酸具有放松神经、抗肿瘤、抗抑郁、保护血管、降血压、抑制肥胖及提高机体免疫功能等医药作用，此外，还可以作为功能性食品添加剂应用于食品领域。因此，茶氨酸越来越受到人们青睐，国际市场对其需求量也很大。

目前，生产茶氨酸的方法主要有三种。一种是从茶叶中提取。茶叶中茶氨酸含量较低，且原料来源受限，致使生产成本很高。第二种方法是化学合成法。该方法不仅会导致毒性物质残留，且生产的茶氨酸为d-茶氨酸和l-茶氨酸异构体的混合物，拆分精制工艺复杂。第三种方法是利用微生物及其酶发酵生产茶氨酸。目前报道的能合成茶氨酸的微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，但这些都是自然界游离微生物，不是从茶树体内分离得到的。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株高产茶氨酸的茶树内生菌，为首次从茶树中分离的内生菌，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述高产茶氨酸的茶树内生菌在产l-茶氨酸中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一株高产茶氨酸的茶树内生菌，其分类命名为罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属(rhodanobacteraceaeluteibactersp.)cse7，保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018816，保藏日期为2018年11月23日；保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学。

所述罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属cse7在制备l-茶氨酸中的应用。

所述的应用：cse7菌株在28℃振荡培养至od600为1.0时，向培养液中同时添加谷氨酰胺和乙胺，培养1～15d，取培养液100℃水浴裂解30min，并于-20℃反复冻融2～3次后，12000rpm，离心15min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤后，进行液相质谱检测；获得含l-茶氨酸的上清液。

所述的应用，添加谷氨酰胺的终浓度为20mm。添加乙胺的终浓度为20mm。

所述的应用，优选培养7d。

本发明产l-茶氨酸的菌株cse7，为首次从茶树中分离的产茶氨酸内生菌，16srdna鉴定为罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属(rhodanobacteraceaeluteibactersp.)。该cse7菌在lb培养基上生长良好，28℃培养2-3d，单菌落成亮黄色。16srdna经扩增、测序、比对后发现与ncbi数据库中罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属(rhodanobacteraceaeluteibactersp.)(genbankaccessionno.km187159).同源性极高，达99％以上。结合菌体形态特征，生长条件确定为罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属，分类命名为罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属(rhodanobacteraceaeluteibactersp.)cse7。

有益效果：与现有技术相比，本发明产l-茶氨酸的菌株，为首次从茶树中分离的产茶氨酸内生菌罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属cse7。该菌株cse7在添加了谷氨酰胺和乙胺的lb培养基上能够合成l-茶氨酸，且合成的茶氨酸能够快速分泌到胞外，分泌效率达90％以上，具有很好的实用性。

附图说明

图1是cse7菌落照片图；

图2是cse7菌落革兰氏染色镜检图；

图3是cse7合成产物茶氨酸的质谱检测结果图。

图4是cse7培养不同时间的茶氨酸合成量变化趋势图。

图5是cse7在培养5d和7d时，茶氨酸分泌效率结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1)cse7菌株的分离

挑取茶树组培苗分泌出的混合内生菌于固体lb平板上进行单克隆的分离，并对分离出的单克隆进行编号和茶氨酸合成能力检测，最终选定cse7为目的株系。之后，对目的株系进行基因组dna的提取，并利用分子克隆技术进行该菌株的16srdna(序列如seqidno.1所示)鉴定，经ncbi数据库比对该菌株属于罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属。

2)cse7菌株的革兰氏染色和形态学鉴定

该菌株菌斑呈圆形，表面光滑、湿润、凸起，不透明黄色，边缘整齐(如图1所示)。经革兰氏染色后呈红色杆状，鉴定该菌株为革兰氏阴性菌(如图2所示)。

3)cse7合成茶氨酸的样品制备及检测过程

该菌株在28℃振荡培养至od600为1.0时，向lb培养液中同时添加终浓度为20mm谷氨酰胺和20mm乙胺，同时分别以不添加任何底物的同浓度菌液和添加同浓度底物的空白培养基作为对照试验，在同样28℃振荡培养条件下，继续培养1d、3d、5d、7d、10d、15d后，分别将不同时间点取得的培养液100℃水浴裂解30min，并于-20℃反复冻融2～3次后，12000rpm，离心15min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤后，进行超高效液相质谱(uplc-ms/ms)检测。

二级质谱鉴定结果表明：培养液中均稳定含有不同浓度的茶氨酸(质谱结果见图3)，且在底物添加后的第7天时，茶氨酸含量平均约3.8mg/l(见图4)，而对照组中，不添加任何底物的同浓度菌液仅检测到极微量茶氨酸，添加同浓度底物的空白培养基未检测到茶氨酸的存在。以此说明，该菌株具有高效合成茶氨酸的能力。

且该菌株合成的茶氨酸能够快速分泌到胞外，分泌效率达90％左右(见图5)。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>一株高产茶氨酸的茶树内生菌cse7及其应用

<130>100

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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<211>1346

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