植物干旱诱导型合成启动子SP15及其应用的制作方法

本发明属于生物技术与基因工程领域，具体涉及一种植物干旱诱导型启动子sp15及其应用。

背景技术：

干旱对植物的影响是多方面的，是一个极其复杂的过程。干旱不仅会影响植物的生长发育，同时会使植物的生理生化代谢平衡被打破，最终导致产量下降和品质降低。大量科学研究表明，植物在受干旱胁迫环境中，可以通过调节关键基因的表达差异来解决干旱带来的不良反应。启动子是实现关键基因差异表达的分子开关，可以控制基因的转录起始、表达强度以及表达部位等，可作为基因工程育种的一个有力工具。

启动子是包含顺式作用元件的dna，位于基因转录起始位点上游，是rna转录起始最重要的控制点。高等植物的启动子序列大多数都可分为两部分：一部分是行使功能所必须的，在启动子中将之称为核心启动子区(corepromoter)，包括起始子(initiator，inr)以及相距较近的tata-box等；而另一部分是决定基因转录的时空特异性与启动子相应活性的上游调控区，调控区中的功能元件可能与一些调节蛋白直接或间接作用来调控rna聚合酶的活性，从而在特定组织中或特定时间内转录出固定量的mrna。在这些功能元件中，其中有些是组成型的，可在植物的各个组织中表达；有些是诱导型的，受到许多内外条件以及时空特异性的调节。

随着现代生物技术的发展，天然启动子已不能满足对基因进行精细调控的需求。人工合成启动子是指人为的设计合成一段能够满足实践需求的启动子序列。本发明公开了一种人工合成启动子的设计，它是将多个干旱响应的功能元件串联设计成组合单元，再与核心启动子区相连而成，通过在大豆发状根体系中的功能验证证实，该人工合成启动子具有干旱胁迫诱导特性，且表达强度与camv35s启动子相当，可应用于植物基因工程育种。

技术实现要素：

本发明目的是为解决天然启动子不能对基因进行精细调控的问题，而提供一种植物干旱诱导型启动子sp15。

一种植物诱导型启动子sp15，它的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种植物表达载体，它是在载体质粒中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；

所述的载体质粒为pcambia3301。

所述的一种植物诱导型启动子sp15在培育抗干旱转基因植物的应用；

所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

发明详述：本发明sp15属于人工合成启动子，是以2个拷贝的g-box元件、1个拷贝的abre元件、2个拷贝的rootspecificmotif、2个拷贝的myb1元件、2个拷贝的myb4元件、2个拷贝的gcc-box元件、2个拷贝的rootspecificmotif组成串联单元，每两个元件中间以10个碱基的特异序列间隔，将以上设计的串联单元分别添加到camv35sminipromoter的两端，再在整个合成序列的3'端加上一个131bp的rootbaseminipromoter序列构建而成，命名为syntheticpromoter15，简称为sp15。

本发明提供了一种植物诱导型启动子sp15，它的核苷酸序列如seqidno.1所示；一种植物表达载体，它是在载体质粒中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；以及启动子sp15在培育抗干旱转基因植物的应用；在大豆发状根转化体系中鉴定sp15启动子驱动报告基因gus的表达情况表明，sp15启动子可以受干旱胁迫所诱导，且表达强度与camv35s启动子相当。

附图说明

图1为sp15与gus融合表达载体图；

图2为转sp15基因大豆发状根在干旱胁迫前后的gus蛋白染色情况。

具体实施方式

实施例1植物干旱诱导型启动子sp15的设计

通过将大豆逆境转录组测序数据与genbank中已有大豆逆境表达谱数据相结合，筛选出受干旱调控的目的基因63个，然后将它们列表进行cluster模块分类；获得4个cluster后，利用motif鉴定软件分别对每个cluster进行motif的鉴定，最终获得46个与逆境调控相关的启动子共有表达元件；选择其中的g-box、abre、rootspecificmotif、myb1、myb4、gcc-box为基本顺式元件，以2个拷贝的g-box元件、1个拷贝的abre元件、2个拷贝的rootspecificmotif、2个拷贝的myb1元件、2个拷贝的myb4元件、2个拷贝的gcc-box元件、2个拷贝的rootspecificmotif组成串联单元，每两个元件中间以10个碱基的特异序列间隔，将以上设计的串联单元分别添加到camv35sminipromoter的两端，再在整个合成序列的3'端加上一个131bp的rootbaseminipromoter序列构建而成，命名为syntheticpromoter15，简称为sp15，其核苷酸序列为seqidno.1序列。

实施例2启动子sp15表达载体的构建

通过人工合成方法将sp15（seqidno.1）序列合成到载体puc57上，并在序列两端添加酶切位点sacl和ncoi；将puc57-sp15载体和pcambia3301质粒，分别用sacl和ncoi进行双酶切，分别回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定，获得表达载体pcambia3301-sp15（图1）；将载体pcambia3301-sp15转化至发根农杆菌k599中，用于浸染大豆子叶节。

实施例3转sp15基因大豆发状根的获得

利用已建立的大豆发状根诱导体系，将含有pcambia3301-sp15载体的发根农杆菌k599侵染大豆子叶节，经诱导和鉴定，获得转基因阳性发状根后；进行干旱胁迫处理；具体方法如下：

（1）用次氯酸钠和浓盐酸1:1混后，对大豆种子进行氯气灭菌过夜；

（2）用无菌水清洗大豆并种到高温高压灭过菌的蛭石中，用1/4霍格兰溶液保湿；

（3）在人工气候室中25℃、光照16小时、培养6天左右；

（4）将含重组质粒pcambia3301-sp15的发根农杆菌k599在28℃培养箱过夜培养；

（5）用刀片刮菌收集菌体；

（6）将发根农杆菌注射到临近子叶的下胚轴处；

（7）注射完成后需保水5~6天；

（8）然后用灭过菌的蛭石将伤口盖住，并保水；

（9）培养15天左右去除真实根，在蛭石中缓苗3天左右后移到霍格兰培养液中培养。

实施例4干旱胁迫处理及gus组织化学染色

培养7天的大豆复合植株（根部为转sp15的发状根，地上为非转基因的大豆植株），用6%peg6000模拟干旱胁迫处理，处理时间为72小时；剪取胁迫处理的大豆发状根，通过gus染色对诱导出的大豆发状根进行染色，染色方法参照中科瑞泰生物科技有限公司的gus染色试剂说明书；染色后避光室温培养6-10小时，然后用无水乙醇或80%的丙酮脱色3次左右，直至阴性对照变为白色为止，然后统计染色情况并拍照留存；结果显示（图2）：转camv35s启动子的根在未胁迫与干旱胁迫后均被染成了蓝色，说明camv35s启动子驱动的gus报告基因表达不受干旱诱导，而sp15启动子驱动的gus基因只在干旱胁迫处理后表达，且其gus染色结果与camv35s启动子驱动的gus染色情况相当，表明sp15为干旱诱导型启动子，且其表达活性近似于camv35s启动子，适合作为利用植物基因工程手段培育抗旱作物新品种的候选启动子。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>植物干旱诱导型合成启动子sp15及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>667

<212>dna

<213>pcambia3301

<400>1

cacgtgtcataacgctcacgtgtcataacgcttacgtggctcataacgctatatttcata60

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