靶向结合Sox2蛋白的多肽药物的合成及应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到靶向结合sox2蛋白的多肽药物的合成及应用。

背景技术：

前期，我们通过建立了高通量的肽适配子文库和筛选方法（具体应用请见专利zl201410339641.x），并筛选获得了几个与sox2蛋白紧密结合的肽适配子（具体应用请见专利zl201510263530.x），同时验证了它们的功能，在此基础上，我们对p42肽适配子进行化学合成和修饰。

sox2蛋白是一个强大的转录因子，在多个肿瘤的恶性进程（如肿瘤发生、肿瘤细胞增殖，侵袭转移，肿瘤干细胞特性维持、化疗药物抗性等）的多个方面起重要作用。

肿瘤细胞增殖实验主要包括细胞计数和克隆形成实验，细胞计数实验可以通过直接计数以及其他检测方法如cck8等方法完成。划痕实验是通过在培养的细胞中进行划痕来检测细胞的迁移能力，它反映肿瘤细胞的运动能力。

肿瘤细胞侵袭实验是一个模拟体内环境，依赖肿瘤细胞分泌蛋白酶降解基质，从而使细胞具备转移能力的能力测试，它从一定程度反映了细胞的侵袭和转移潜能。而成瘤实验可在小鼠体内真实反映处理后的细胞肿瘤再生能力，常用于药物的筛选。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个具有特定空间构象并能特异靶向结合sox2蛋白的多肽药物的合成及应用。通过细胞增殖实验、划痕、细胞侵袭以及成瘤实验对该多台药物的功能鉴定，表明该多肽药物使细胞增殖速率降低，细胞迁移能力、侵袭能力下降，成瘤能力差，具有显著的肿瘤抑制功能，具有重要的应用价值。

靶向结合sox2蛋白的多肽药物，其序列为：tamra-ygrkkrrqrrrcgpvwfstlffplfflislargpc。该序列包含特异靶向结合sox2蛋白的肽适配子fstlffplffl，同时在其氨基端添加了红色荧光标记基团tamra和穿透肽序列ygrkkrrqrrr。

上述靶向结合sox2蛋白的多肽药物经化学合成，并让其中的2个半胱氨酸形成一个二硫键，以此形成具有特定结构的空间构象。同时化学合成没有特异靶向结合sox2蛋白的肽适配子fstlffplffl的tamra-ygrkkrrqrrrcgpv

wislargpc作为对照。

上述靶向结合sox2的多肽药物的化学合成方法为：以fmoc-aa树脂为原料，以hobt为活化剂，dic为缩合剂，collidine为碱试剂合成带保护的肽树脂；再经切割液切割得肽粗品；肽粗品经空气氧化法氧化获得精品多肽药物。其中fmoc-aa：dic：hobt：collidine的体积比为1:1:1:2,fmoc-aa缩合过程用量过量2.5倍，每一步缩合都经过凯撒试剂（kaisertest）检测，如颜色呈阳性则重复缩合氨基酸；切割液为：三氟醋酸：edt：水：对甲酚的体积比为87.5：5：2.5：5；空气氧化法为：肽粗品溶于纯水，用氨水调ph值到9，室温搅拌反应24小时。

上述靶向结合sox2蛋白的多肽药物功能的鉴定，包括以下步骤：

1）肿瘤细胞增殖实验：在接种同样量细胞的食管鳞癌细胞kyse450细胞培养基中添加靶向结合sox2蛋白的多肽药物和对照，并在一天后，往细胞培养基中加入cck8，在第三天、第五天、第七天测定每个孔的吸光值od450和od650，以此反映细胞的增殖情况并统计分析；

2）肿瘤细胞划痕实验：在接种同样量细胞的食管鳞癌细胞kyse450细胞培养基中添加靶向结合sox2蛋白的多肽药物peptide42和对照，并在一天后，用枪头在细胞中划线，用pbs清洗后拍照，48小时后，在最初拍照划痕位置继续拍照，并统计结果；

3）肿瘤细胞侵袭实验：将同样量的食管鳞癌细胞kyse450细胞接种到涂布matrigel的transwell小室后，在上室培养基中添加0.02ug/ul的等量多肽药物peptide42和对照，上室的血清浓度为5vol%，下室血清浓度为20vol%，48小时后观察穿透膜的细胞并计数和统计分析；

4)肿瘤细胞成瘤实验：将同样量的食管鳞癌细胞kyse450细胞和matrigel混合后接种到裸鼠皮下，在肉眼可见的肿瘤形成后，分别注射等量的靶向结合sox2蛋白的多肽药物peptide42和对照，经多次注射后，观察肿瘤的生长并对形成的肿瘤进行剥离和称重，统计分析。

本发明的有益效果在于：

（1）通过化学合成方法，获得了空间构象固定，并利于示踪和穿透进入细胞的多肽药物peptide42和对照；

（2）利用细胞增殖、细胞划痕修复、细胞侵袭体外实验证实了靶向结合sox2蛋白的多肽药物peptide42对肿瘤细胞恶性进程的抑制作用；

（3）利用体内成瘤实验，证实了靶向结合sox2蛋白的多肽药物peptide42对肿瘤起始发生起抑制作用，能被用于制备食管鳞癌治疗的候选药物。

附图说明

图1多肽药物和对照的空间构象图。a：多肽药物peptide42的空间构象图；b：对照的空间构象图。

图2kyse450细胞经多肽药物peptide42和对照处理后的增殖实验结果图。

图3kyse450细胞经多肽药物peptide42和对照处理后的划痕修复实验结果图。a：多肽药物peptide42和对照处理后的kyse450细胞划痕修复结果；b：多肽药物peptide42和对照处理kyse450细胞的伤痕愈合率柱形分析统计结果。

图4kyse450细胞经多肽药物peptide42和对照处理后的侵袭实验结果图。a：多肽药物peptide42和对照处理后的kyse450细胞侵袭结果；b：多肽药物peptide42和对照处理kyse450细胞侵袭柱形分析统计结果。

图5kyse450细胞皮下成瘤多肽药物peptide42和对照处理实验结果图。a：多肽药物peptide42和对照处理后的kyse450细胞荷瘤裸鼠图；b：多肽药物peptide42和对照处理后的kyse450细胞在裸鼠体内成瘤后剥离的肿瘤图；c：多肽药物peptide42和对照处理后的kyse450细胞在裸鼠体内成瘤的肿瘤统计柱形结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂销售店获取。以下实施例中的定量实验，均设置为独立的三次重复实验，结果取平均值。

实施例1靶向结合sox2的多肽药物的化学合成

靶向结合sox2的多肽药物的化学合成方法为：以fmoc-aa树脂为原料，以hobt为活化剂，dic为缩合剂，collidine为碱试剂合成带保护的肽树脂；再经切割液切割得肽粗品；肽粗品经空气氧化法氧化获得精品多肽药物。其中fmoc-aa：dic：hobt：collidine体积比为1:1:1:2,fmoc-aa缩合过程用量过量2.5倍，每一步缩合都经过凯撒试剂（kaisertest）检测，如颜色呈阳性则重复缩合氨基酸。

所需合成多肽的序列为：对照：tamra-ygrkkrrqrrrcgpvwislargpc和多肽药物peptide42：tamra-ygrkkrrqrrrcgpvwfstlffplfflislargpc。

序列中各氨基酸投料量及试剂的投料量的计算：

以k表示过量2.5倍的投料量。

k=2.5×m树脂×loading=2.5×2g×0.26mmol/g=1.3mmol

活化剂:m(hobt)=m(hobt)×k=0.135g/mmol×1.3mmol=0.176g

缩合剂:v(dic)=m(dic)×k/0.81=0.126g/mmol×1.3mmol/0.81g/ml=0.2ml

碱试剂：

v(collidine)=2×m(collidine)×k/0.80g/ml=2×0.124g/mmol×1.3mmol/0.80g/ml=0.40ml

m(pro)=m(pro)×k=0.3374g//mmol×1.3mmol=0.439g

m(gly)=m(gly)×k=0.2973g/mmol×1.3mmol=0.386g

m(arg)=m(arg)×k=0.6448g/mmol×1.3mmol=0.838g

m(ala)=m(ala)×k=0.3113g/mmol×1.3mmol=0.404g

m(leu)=m(leu)×k=0.3534g/mmol×1.3mmol=0.459g

m(ser)=m(ser)×k=0.3834g/mmol×1.3mmol=0.498g

m(ile)=m(ile)×k=0.3534g/mmol×1.3mmol=0.459g

m(trp)=m(trp)×k=0.5265g/mmol×1.3mmol=0.684g

m(val)=m(val)×k=0.3224g/mmol×1.3mmol=0.419g

m(cys)=m(cys)×k=0.5857g/mmol×1.3mmol=0.761g

m(gln)=m(gln)×k=0.6107g/mmol×1.3mmol=0.794g

m(lys)=m(lys)×k=0.4685g/mmol×1.3mmol=0.609g

m(tyr)=m(tyr)×k=0.4596g/mmol×1.3mmol=0.597g

m(tamra)=m(tamra)×k=0.430g/mmol×1.3mmol=0.559g

靶向结合sox2的多肽药物的化学合成的具体步骤为：

1）合成带保护的肽树脂

①脱fmoc保护基团

取2gfmoc-cys(trt)-2-chlorotritylresin放入接肽瓶中，该树脂的取代度为0.26mmol/g，加入适量ch2cl2使树脂膨胀，然后把ch2cl2抽掉。加入12ml20vol%piperidine/dmf溶液振荡5min，抽干，再加入12ml20vol%piperidine/dmf溶液振荡15min，然后抽干，用dmf洗3次，meoh洗3次，ch2cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作kaisertest检测呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。

②fmoc-pro-oh的缩合

称取fmoc-pro-oh0.439g，hobt0.176g加入上面接肽瓶中。加入12ml(ar)级的dmf，0.4mlcollidine，0.2mldic，密封后放入振荡器中反应1小时，温度控制在35°c，反应结束后，将反应液抽干，用dmf洗树脂3次，meoh洗3次，ch2cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作kaisertest显阴性，假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全kaisertest显阴性通过。再脱fmoc保护基团加入12ml20vol%piperidine/dmf溶液振荡5min，抽干，再加入12ml20vol%piperidine/dmf溶液振荡15min，然后抽干，用dmf洗3次，meoh洗3次，ch2cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作kaisertest检测呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。

③再依次缩合fmoc-gly-oh，fmoc-arg(pbf)-oh等，序列中的氨基酸，缩合过程是从c端往n端逐个缩合，缩合方法同步骤2的fmoc-pro-oh相同，合成带保护的肽树脂。

2）切割得肽粗品

将步骤1得到的保护的肽树脂加入到20ml的三氟醋酸：edt：水：对甲酚体积比为87.5：5：2.5：5的混合液中，室温振荡2.5小时，过滤，用三氟醋酸洗树脂2次，滤液加无水乙醚得白色固体，反复用无水乙醚洗涤，得肽粗品0.45g。

3）氧化得精品多肽

称取0.3g肽粗品溶于200ml纯水，用氨水调ph值到9，室温搅拌反应24小时后，取样品检测ms，等氧化完全后，经过分离纯化冷冻后得到98%的精品多肽。制备所得的多肽药物peptide42和对照的空间构象图见图1。

实施例2

靶向结合sox2的多肽药物用于食管鳞癌治疗增殖分析，包括以下步骤：

1）对食管鳞癌细胞kyse450使用胰酶消化离心后进行细胞计数，96孔板中每孔接种1000个细胞。在接种时添加含有0.02ug/ul浓度化学合成多肽peptide42或对照的完全培养基培养细胞。每组重复5孔，共四组。

2）培养24h，吸去旧培养基，每孔加入100μl新鲜完全培养基，并加入10μlcck8溶液。

3）在细胞培养箱内继续培养0.5-4h后，450nm和650nm波长下分别测定其吸光值od450和od650。

4）分别在第三天，第五天，第七天重复步骤2，3。

5）用graphpad软件对吸光值数据进行统计分析。每个实验重复三次，采用方差统计t检验。

结果见图2，图2结果表明：与对照组相比，多肽peptide42能显著抑制食管鳞癌细胞kyse450细胞的增殖。

实施例3

靶向结合sox2的多肽药物用于食管鳞癌治疗划痕分析，包括以下步骤：

1）使用10cmdish培养kyse450细胞，待丰度达到80%时，用胰酶消化后离心，并计数细胞，在6孔细胞培养板中每孔接种1×10⁶个细胞，接种时使用含有0.02μg/μl浓度化学合成多肽peptide42和对照的完全培养基培养细胞，并在接下来的过程中使用同样的培养基；

2）待细胞贴壁培养达到80%的丰度时，在超净工作台中用灭菌的200μl黄色枪头划线，使划线的宽度一致，便于后期的统计观察；

3）划线完后用pbs洗两遍，洗去残留漂浮细胞，并在放大倍数为40×显微镜下拍照，便于与迁移后进行比较。

4）48小时候，继续在前次拍照位置进行拍照（图3a所示），采用image-proplus6软件统计细胞迁移的面积并计算迁移率（图3b所示），由图可知，与对照相比，添加了多肽药物peptide42后，细胞的迁移能力显著降低。

实施例4

靶向sox2的合成多肽药物用于食管鳞癌治疗侵袭分析，包括以下步骤：

1）消化kyse450细胞，离心后计数，每个小室接种1×10⁴个细胞

2）将matrigel处理过的小室插入培养的24孔板中，下室为20vol%fbs的rpmi1640培养基；

3）接种后的第二天，使用含有0.02μg/μl浓度化学合成多肽peptide42和对照添加至上室细胞培养基中;

4）在细胞培养箱内培养48h后进行细胞固定和结晶紫染色；

5）吸去小室内部培养基，用棉签刮掉内部未迁移的细胞；

6）小室浸入pbs中把残余培养基洗净后放置到4%paf液中固定15min；

7）pbs洗两次，然后转移小室浸入到1%结晶紫水溶液中，室温染色30min；

8）用水把表面残留的结晶紫晾干，小室放置到载玻片上，倒置显微镜下拍照观察（图4a所示）；

9）对每组4个重复进行细胞计数后经graphpadprism5软件统计分析（图4b所示）。每个实验重复三次，采用方差统计t检验。由图可知，与对照相比，添加了多肽药物peptide42后，细胞的侵袭能力显著降低。

实施例5

靶向结合sox2的多肽药物用于食管鳞癌治疗体内成瘤能力分析，包括以下步骤：

1）用胰酶消化处于对数生长期的kyse450细胞，用完全培养液收集细胞到15ml离心管（培养皿用pbs洗1-2次以充分收集细胞）。用pbs清洗细胞3次，用无血清培养基和matrigel体积比为1:1的混合液重悬细胞，细胞浓度为2.5×10⁷个/ml。

2）在裸鼠的背部双侧皮下注射0.2ml细胞悬液，裸鼠为4周龄雄性。

3）密切观察裸鼠的成瘤情况。在小鼠体内形成肉眼可见的肿瘤时（注射细胞1周后），每隔一天往肿瘤体内注射100μl0.04μg/μl多肽药物peptide42和对照,共注射10次（图5a所示）。

4）四周后处死裸鼠；取出皮下肿瘤，拍照、称重（图5b所示），并将各组重量进行统计学分析（图5c所示）。由图可知，与对照相比，注射了多肽药物peptide42后，细胞的体内成瘤能力显著降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>中国人民解放军南京军区福州总医院

<120>靶向结合sox2蛋白的多肽药物的合成及应用

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