用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用的制作方法

本发明属于动物传染学领域，具体涉及用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用。

背景技术：

猪圆环病毒（porcinecircovirus,pcv）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：pcv1、pcv2和pcv3。pcv1为非致病性的病毒；pcv2为致病性的病毒；pcv3的有无致病力需要更进一步深入明确。研究发现，pcv2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaningmultisystemicwastingsyndrome,pmws），皮炎与肾病综合征(pnds)的主要病原。

对pcv1和pcv2的基因组进行分析发现，pcv1基因组全长1759bp，pcv2全长1768bp（或1767bp）。orf1是pcv1和pcv2最大的开放阅读框（orf），位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（rep），分子量大小为37kda，与病毒的复制转录有关。

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（pdns）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（porcinecircovirus3，pcv3）。作为一种新发现病原体，pcv3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（pcvad）中作用以及现有商品化pcv2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。和pcv1、pcv2一样，pcv3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股dna病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白rep和与抗原相关的抗原蛋白cap。

一般而言，对三种或以上的病原进行同时pcr扩增较为困难，尤其三种核苷酸同源性低于80%，且基因组长度不同的病原进行检测，需要分别设计引物，再进行分别扩增。即一般需要设计6条引物，才可以对猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）进行扩增。但是6条引物在条件优化上均为繁琐复杂，且引物越多可能导致的潜在交叉可能性越大，较难达到相关研究目的。本发明最大的优点是基于猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的基因组结构特点，选择猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的基因组特异性保守区作为上游引物设计区域，在分别根据3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的基因组的差异区分别设计针对下游引物：p2引物设计区域为针对pcv1保守，但和pcv2和pcv3差异大；p3引物设计区域为针对pcv2保守，但和pcv1和pcv3差异大；p4引物设计区域为针对pcv3保守，但和pcv1和pcv2差异大。基于本原理设计的引物，条件优化简单、方便快速，结果观察方便，组装的试剂盒可用于猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的快速鉴别诊断。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供了一种方便快速，结果观察方便的猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）鉴别pcr检测引物。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

用于鉴别pcv1、pcv2和pcv3的引物组，所述引物组其核苷酸序列如下所示：

引物p1：5’-tattttggatgayttttatgg-3’；

引物p2：5’-gcacaccccgccttcagaaa-3’；

引物p3：5’-ccaaacctgttcttgattccacta-3’；

引物p4：5’-agtgcaaataaaatcaatagtt-3’。

所述的引物组用于检测pcv1、pcv2和pcv3的方法，包含以下步骤：

（1）从疑似临床样品中提取基因组dna；

（2）以提取的dna为模板，用所述的引物组pcr扩增；

（3）该组引物对pcv1、pcv2和pcv3均可有效扩增，其中pcv1为964bp，pcv2为563bp，pcv3为287bp。

所述的引物组在制备鉴别pcv1、pcv2和pcv33种猪圆环病毒pcr检测试剂盒上的应用。

本发明的优点在于：

本发明是基于猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的基因组结构特点，选择猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的基因组特异性保守区作为上游引物设计区域，在分别根据3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的基因组的差异区分别设计针对下游引物：p2引物设计区域为针对pcv1保守，但和pcv2和pcv3差异大；p3引物设计区域为针对pcv2保守，但和pcv1和pcv3差异大；p4引物设计区域为针对pcv3保守，但和pcv1和pcv2差异大。基于本原理设计的引物，条件优化简单、方便快速，结果观察方便，组装的试剂盒可用于猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的快速鉴别诊断。

附图说明

图13种猪圆环病毒基因组核苷酸比较。

图2引物p1设计区域。

图3引物p2设计区域。

图4引物p3设计区域。

图5引物p4设计区域。

图6pcr产物凝胶电泳鉴定。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

猪圆环病毒1型（pcv1）和猪圆环病毒2型（pcv2）、猪圆环病毒3型（pcv3）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

2、主要试剂

easypureviraldna/rnakit购自北京全式金生物技术有限公司；pcr扩增试剂盒（quicktaqhsdyemix）购自toyobo公司。

3、核苷酸序列分析

选择pcv1代表株（pk株，genbank登陆号dg650650；bj-1株，genbank登陆号fj475129）pcv2代表株（jz-9株，genbank登陆号mh059556；pcv-45株，genbank登陆号kc514989）和pcv3代表株（pcv3-cn2018ln-2株，genbank登陆号mh277116；pcv3-cn2018ln-3株，genbank登陆号mh277117）为例，选择dnastar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见（图1）：pcv1和pcv3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.3%左右）；pcv1和pcv2的基因组核苷酸在77.7%-77.8%之间；pcv2和pcv3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.4%左右）。

4、引物设计

4.1上游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的保守区来设计上游引物，设计的引物p1序列为：

引物p1：5’-tattttggatgayttttatgg-3’；

引物p1的设计区域见图2，该区域可对3种猪圆环病毒（pcv1、pcv2和pcv3），y表示修饰引物。

4.2下游引物设计

4.2.1pcv1下游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的差异区来设计针对pcv1下游引物p2，序列为：

引物p2：5’-gcacaccccgccttcagaaa-3’；

引物p2的设计区域见图3（下游引物位反向互补区域），p2引物设计区域为针对pcv1保守，但和pcv2、pcv3差异大。

4.2.2pcv2下游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的差异区来设计针对pcv2下游引物p3，序列为：

引物p3：5’-ccaaacctgttcttgattccacta-3’；

引物p3的设计区域见图4（下游引物位反向互补区域），p3引物设计区域为针对pcv2保守，但和pcv1、pcv3差异大。

4.2.3pcv3下游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（pcv1、pcv2和pcv3）的差异区来设计针对pcv3下游引物p4，序列为：

引物p4：5’-agtgcaaataaaatcaatagtt-3’；

引物p4的设计区域见图5（下游引物位反向互补区域），p4引物设计区域为针对pcv3保守，但和pcv1、pcv2差异大。

5、pcr方法的建立

5.1核酸dna的提取

以试剂盒说明书进行，提取猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪圆环病毒3型（pcv3）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）的基因组核酸dna。

5.2pcr条件优化

以提取pcv1、pcv2和pcv3的基因组dna，分别作为模板。用所设计的特异性pcr引物p1和p2进行常规pcr扩增，并对退火温度（50-60）℃进行优化。按照quicktaqhsdyemix扩增试剂盒推荐的50μl配置pcr反应液：quicktaqhsdyemix25μl、上/下游引物（10μmeach）各1μl、模板1μl、水补足至50μl。经过优化后，55℃位最佳退火温度，此时pcv1（引物使用p1和p2）、pcv2（引物使用p1和p3）和pcv3（引物使用p1和p4）均可有效扩增。优化后的最佳反应条件为：94℃2min预变性；94℃40s、55℃30s、72℃30s，共30个循环，72℃总延伸10min。

5.3引物浓度优化

以提取pcv1、pcv2和pcv3的基因组dna，定量后混匀后作为模板，引物p1、p2、p3、p4分别按照（1：1：1：1、2：1：1：1、4：1：1：1、8：1：1：1、16：1：1：1、）分别进行优化。优化后的反应体系为quicktaqhsdyemix25μl、引物p1（10μm）2μl、引物p2（10μm）0.5μl、引物p3（10μm）0.5μl、引物p4（10μm）0.5μl、模板1μl、水补足至50μl。

5.4特异性实验

以优化后条件对猪群常见传染病，如猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪圆环病毒3型（pcv3）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）进行扩增，判断本研究的特异性。结果可见（图6），仅pcv1（图6第1泳道）、pcv2（图6第2泳道）和pcv3（图6第3泳道）出现阳性特异性扩增条带，而ppv（图6第8泳道）、prv（图6第9泳道）、v-prv（图6第10泳道）、prrsv（图6第11泳道）、pedv（图6第12泳道）和阴性对照（图6第13泳道）均未见条带扩增。

5.5结果判定

若出现扩增大小为964bp，判定为pcv1阳性（图6第1泳道）；若出现扩增大小为563bp，判定为pcv2阳性（图6第2泳道）；若出现扩增大小为287bp，判定为pcv3阳性（图6第3泳道）；若出现扩增大小为964bp和563bp，判定为pcv1和pcv2阳性（图6第4泳道）；若出现扩增大小为563bp和287bp，判定为pcv2和pcv3阳性（图6第5泳道）；若出现扩增大小为964bp和287bp，判定为pcv1和pcv3阳性（图6第6泳道）；若出现扩增大小为964bp、563bp和287bp，判定为pcv1、pcv2和pcv3阳性（图6第7泳道）；若未出现相关目的条带，则判定为检测结果阴性。

6、临床应用

应用本方法对临床送检179份猪pmws病料进行检测，将病料按照常规方法研磨处理后，利用核酸提取试剂盒提取病毒的基因组dna，利用优化后的方法和条件进行pcr检测。结果可见，pcv1单一阳性2份，阳性率为1.12%；pcv2单一阳性124份，阳性率为52.51%；pcv3单一阳性5份，阳性率为2.79%；pcv1和pcv2单一阳性4份，阳性率为2.23%；pcv1和pcv3单一阳性4份，阳性率为2.23%；pcv2和pcv3单一阳性14份，阳性率为7.82%；pcv1、pcv2和pcv3单一阳性3份，阳性率为1.68%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农科院畜牧兽医研究所

<120>用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用

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<160>4

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

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ccaaacctgttcttgattccacta24

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agtgcaaataaaatcaatagtt22